【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是全世界常見(jiàn)腫瘤,惡性程度高,預(yù)后差。在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均較高,死亡率位居所有惡性腫瘤第二位。大部分患者就診時(shí)已經(jīng)為中晚期,手術(shù)切除率不足20%。雖然隨著手術(shù)的進(jìn)步及放化療等綜合手段的應(yīng)用,肝癌的治療效果較前改善,但遠(yuǎn)期效果依然較差。術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移也是影響預(yù)后的重要因素。因而,探索肝癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、尋求新的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高肝癌的治療效果、改善預(yù)后具有重要意義。WTX位于X染色體上的,其功能主要表現(xiàn)為抑制腫瘤,WTX基因的單次突變就有可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明,WTX基因在Wilms瘤、白血病以及胃癌、結(jié)腸癌中均有存在,并對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有影響。但是WTX基因與肝癌的關(guān)系及作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)圍繞WTX與肝癌的關(guān)系及其可能的機(jī)制進(jìn)行研究。目的:一,檢測(cè)WTX基因在肝癌患者組織樣本及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,分析WTX表達(dá)在肝癌組織及癌旁對(duì)照組織的差異表達(dá),探究其表達(dá)與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系,從而明確WTX基因在肝癌組織中的表達(dá)狀態(tài)及其臨床研究?jī)r(jià)值,同時(shí)分析WTX基因在肝癌細(xì)胞系中的差異性表達(dá)。二,通過(guò)在低表達(dá)的肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)WTX基因的質(zhì)粒,以及通過(guò)干擾RNA方法低表達(dá)肝癌細(xì)胞中WTX基因,然后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn),探究WTX對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響。三,通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選WTX基因影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的下游通路,進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WTX的具體調(diào)控機(jī)制,從而尋找WTX作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的標(biāo)志分子,以及為作為肝癌靶向治療的目標(biāo)提供依據(jù)。方法:一,首先,收集江西省人民醫(yī)院49例肝臟切除術(shù)后保存的肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織,所有患者術(shù)前均沒(méi)有其他的惡性腫瘤相關(guān)的疾病,而同時(shí)患者也未接受過(guò)放任何生物治療、化療以及放療等治療手段。其中,癌旁組織,選擇標(biāo)準(zhǔn)為距病灶邊緣2cm以上。所有肝癌病灶組織都進(jìn)行病理切片,并通過(guò)病理學(xué)的診斷,確診為肝癌。其次,采用免疫組化方法、Western Blot、熒光定量PCR方法,對(duì)收集的肝癌組織以及對(duì)照癌旁組織,檢測(cè)其中WTX蛋白水平和m RNA的表達(dá)情況。最后,收集患者的臨床病理資料,數(shù)據(jù)內(nèi)容包括肝癌的分期、性別、是否感染HBV、腫瘤大小、預(yù)后等資料,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析WTX的表達(dá)的臨床意義。此外,收集肝細(xì)胞株L02以及肝癌細(xì)胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H,采用Western Blot以及熒光定量PCR的方法檢測(cè)WTX基因的表達(dá)情況。二,利用脂質(zhì)體法將高表達(dá)WTX基因的質(zhì)粒和對(duì)照空質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入低表達(dá)WTX基因的肝癌細(xì)胞株Hep G2、SMMC-7721,并通過(guò)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定高表達(dá)WTX基因的細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系。通過(guò)Western Blot以及熒光定量PCR的方法驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。通過(guò)CCK8、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transewll、裸鼠皮下成瘤等實(shí)驗(yàn)手段,闡述高表達(dá)WTX對(duì)肝癌細(xì)胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)功能的影響。采用干擾RNA技術(shù)在相對(duì)高表達(dá)WTX基因肝癌細(xì)胞MHCC97L中抑制WTX的表達(dá),并采用CCK8、劃痕實(shí)驗(yàn)、transewll等功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證低表達(dá)WTX后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)功能的影響。三,通過(guò)查詢TCGA、GEO等公共在線數(shù)據(jù)庫(kù),研究WTX在肝癌中的表達(dá)情況及可能相關(guān)的下游通路。通過(guò)Western Blot方法以及熒光素酶報(bào)告基因等方法驗(yàn)證高表達(dá)WTX后,肝癌細(xì)胞中Wnt的信號(hào)通路的變化。高表達(dá)WTX同時(shí)改變?chǔ)?catenin,檢測(cè)TCF家族的轉(zhuǎn)錄活性變化。結(jié)果:一,1、免疫組化和Western Blot以及熒光定量PCR結(jié)果結(jié)果顯示,WTX基因表達(dá)情況在肝癌組織中明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、WTX基因的表達(dá)水平與肝癌的臨床TNM程度顯著相關(guān)(P0.05)。3生存分析結(jié)果顯示,WTX基因高表達(dá)的患者其預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組。4、Western Blot結(jié)果顯示正常肝細(xì)胞株L02中WTX的表達(dá)顯著高于肝癌細(xì)胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H的表達(dá)。而熒光定量PCR的方法也證明了相似的結(jié)論。二,1利用脂質(zhì)體法將WTX基因的質(zhì)粒和對(duì)照空質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)系HepG2、SMMC-7721,并通過(guò)嘌呤霉素篩選,采用Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入WTX質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞中,WTX的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。熒光定量PCR的方法結(jié)果證明了在m RNA水平上,WTX基因也顯著高表達(dá)。以上結(jié)果提示,WTX穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系建立成功。2、CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Hep G2、SMMC-7721等肝癌細(xì)胞系中,WTX高表達(dá)細(xì)胞系的增殖能力明顯弱于對(duì)照組。3、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高表達(dá)WTX的肝癌細(xì)胞系其克隆形成能力明顯弱于對(duì)照組。4、劃痕實(shí)驗(yàn)和trasnswell實(shí)驗(yàn)證明,高表達(dá)WTX能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲以及遷移的作用。5、皮下移植瘤模型結(jié)果顯示,高表達(dá)WTX的肝癌細(xì)胞其成瘤能力顯著弱于對(duì)照細(xì)胞。6、通過(guò)轉(zhuǎn)染W(wǎng)TX的干擾RNA,在肝癌細(xì)胞系MHCC97L中低表達(dá)WTX。7、CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MHCC97L肝癌細(xì)胞系中,低表達(dá)WTX能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞系的增殖能力。8、劃痕實(shí)驗(yàn)和trasnswell實(shí)驗(yàn)證明,低表達(dá)WTX能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲以及遷移的作用。三,1、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn),在肝癌組織中,WTX基因的表達(dá)明顯呈現(xiàn)相對(duì)低表達(dá)的狀態(tài)。2、通過(guò)cbioportal工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGGpathway數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)WTX表達(dá)相關(guān)基因能夠富集到Wnt信號(hào)通路中。WTX相關(guān)基因中與Wnt通路重疊基因有25個(gè),提示W(wǎng)TX在肝癌中可能與Wnt通路相關(guān)。3、通過(guò)Western Blot方法驗(yàn)證高表達(dá)WTX后,發(fā)現(xiàn)WTX高表達(dá)后β-catenin表達(dá)明顯下降,提示W(wǎng)TX發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)制可能是通過(guò)降低β-catenin的表達(dá),從而抑制Wnt通路,繼而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的能力。4通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),WTX高表達(dá)后TCF的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降,從而也證明Wnt通路被抑制。5高表達(dá)WTX同時(shí)再上調(diào)β-catenin,能夠使TCF的轉(zhuǎn)錄活性得到逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:一,WTX基因在肝癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài),并且與TNM分期顯著相關(guān),WTX基因高表達(dá)的患者其預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組。二,高表達(dá)WTX能夠抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,高表達(dá)WTX能顯著抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖和轉(zhuǎn)移能力;并且可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。低表達(dá)WTX能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力。三,WTX基因在肝癌組織中處于低表達(dá)狀態(tài),并且WTX表達(dá)相關(guān)基因能夠富集在Wnt通路上。WTX基因能夠降低β-catenin的表達(dá),降低TCF家族的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制Wnt通路,繼而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的能力。WTX調(diào)控TCF家族的轉(zhuǎn)錄是依賴(lài)于β-catenin的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2356053