發(fā)布時間：2018-11-25 12:09

【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是全世界常見腫瘤,惡性程度高,預后差。在我國的發(fā)病率和死亡率均較高,死亡率位居所有惡性腫瘤第二位。大部分患者就診時已經(jīng)為中晚期,手術切除率不足20%。雖然隨著手術的進步及放化療等綜合手段的應用,肝癌的治療效果較前改善,但遠期效果依然較差。術后復發(fā)與轉移也是影響預后的重要因素。因而,探索肝癌發(fā)生發(fā)展以及轉移的分子機制、尋求新的治療靶點對于提高肝癌的治療效果、改善預后具有重要意義。WTX位于X染色體上的,其功能主要表現(xiàn)為抑制腫瘤,WTX基因的單次突變就有可能會導致腫瘤的發(fā)生。研究表明,WTX基因在Wilms瘤、白血病以及胃癌、結腸癌中均有存在,并對腫瘤的侵襲轉移有影響。但是WTX基因與肝癌的關系及作用機制尚不清楚。本實驗圍繞WTX與肝癌的關系及其可能的機制進行研究。目的:一,檢測WTX基因在肝癌患者組織樣本及肝癌細胞系中的表達情況,分析WTX表達在肝癌組織及癌旁對照組織的差異表達,探究其表達與肝癌臨床病理特征之間的關系,從而明確WTX基因在肝癌組織中的表達狀態(tài)及其臨床研究價值,同時分析WTX基因在肝癌細胞系中的差異性表達。二,通過在低表達的肝癌細胞中轉染高表達WTX基因的質粒,以及通過干擾RNA方法低表達肝癌細胞中WTX基因,然后進行細胞學功能實驗,探究WTX對肝癌細胞惡性表型的影響。三,通過生物信息學方法篩選WTX基因影響肝癌細胞的生物學行為的下游通路,進一步通過實驗驗證WTX的具體調控機制,從而尋找WTX作為預測肝癌預后的標志分子,以及為作為肝癌靶向治療的目標提供依據(jù)。方法:一,首先,收集江西省人民醫(yī)院49例肝臟切除術后保存的肝癌組織及其對應的癌旁組織,所有患者術前均沒有其他的惡性腫瘤相關的疾病,而同時患者也未接受過放任何生物治療、化療以及放療等治療手段。其中,癌旁組織,選擇標準為距病灶邊緣2cm以上。所有肝癌病灶組織都進行病理切片,并通過病理學的診斷,確診為肝癌。其次,采用免疫組化方法、Western Blot、熒光定量PCR方法,對收集的肝癌組織以及對照癌旁組織,檢測其中WTX蛋白水平和m RNA的表達情況。最后,收集患者的臨床病理資料,數(shù)據(jù)內(nèi)容包括肝癌的分期、性別、是否感染HBV、腫瘤大小、預后等資料,應用統(tǒng)計學方法分析WTX的表達的臨床意義。此外,收集肝細胞株L02以及肝癌細胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H,采用Western Blot以及熒光定量PCR的方法檢測WTX基因的表達情況。二,利用脂質體法將高表達WTX基因的質粒和對照空質粒,轉入低表達WTX基因的肝癌細胞株Hep G2、SMMC-7721,并通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定高表達WTX基因的細胞系和對照細胞系。通過Western Blot以及熒光定量PCR的方法驗證穩(wěn)定細胞系構建成功。通過CCK8、克隆形成實驗、劃痕實驗、transewll、裸鼠皮下成瘤等實驗手段,闡述高表達WTX對肝癌細胞增殖以及侵襲轉移生物學功能的影響。采用干擾RNA技術在相對高表達WTX基因肝癌細胞MHCC97L中抑制WTX的表達,并采用CCK8、劃痕實驗、transewll等功能學實驗中驗證低表達WTX后對肝癌細胞增殖以及侵襲轉移生物學功能的影響。三,通過查詢TCGA、GEO等公共在線數(shù)據(jù)庫,研究WTX在肝癌中的表達情況及可能相關的下游通路。通過Western Blot方法以及熒光素酶報告基因等方法驗證高表達WTX后,肝癌細胞中Wnt的信號通路的變化。高表達WTX同時改變β-catenin,檢測TCF家族的轉錄活性變化。結果:一,1、免疫組化和Western Blot以及熒光定量PCR結果結果顯示,WTX基因表達情況在肝癌組織中明顯低于對應的癌旁組織,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、WTX基因的表達水平與肝癌的臨床TNM程度顯著相關(P0.05)。3生存分析結果顯示,WTX基因高表達的患者其預后明顯優(yōu)于低表達組。4、Western Blot結果顯示正常肝細胞株L02中WTX的表達顯著高于肝癌細胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H的表達。而熒光定量PCR的方法也證明了相似的結論。二,1利用脂質體法將WTX基因的質粒和對照空質粒,轉入肝癌細系HepG2、SMMC-7721,并通過嘌呤霉素篩選,采用Western Blot結果顯示轉入WTX質粒的肝癌細胞中,WTX的表達量明顯高于對照組。熒光定量PCR的方法結果證明了在m RNA水平上,WTX基因也顯著高表達。以上結果提示,WTX穩(wěn)定表達的細胞系建立成功。2、CCK8實驗結果顯示,Hep G2、SMMC-7721等肝癌細胞系中,WTX高表達細胞系的增殖能力明顯弱于對照組。3、克隆形成實驗結果顯示,高表達WTX的肝癌細胞系其克隆形成能力明顯弱于對照組。4、劃痕實驗和trasnswell實驗證明,高表達WTX能夠顯著抑制肝癌細胞的侵襲以及遷移的作用。5、皮下移植瘤模型結果顯示,高表達WTX的肝癌細胞其成瘤能力顯著弱于對照細胞。6、通過轉染W(wǎng)TX的干擾RNA,在肝癌細胞系MHCC97L中低表達WTX。7、CCK8實驗結果顯示,MHCC97L肝癌細胞系中,低表達WTX能夠顯著增強細胞系的增殖能力。8、劃痕實驗和trasnswell實驗證明,低表達WTX能夠顯著增強肝癌細胞的侵襲以及遷移的作用。三,1、GEO數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),在肝癌組織中,WTX基因的表達明顯呈現(xiàn)相對低表達的狀態(tài)。2、通過cbioportal工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫和KEGGpathway數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)WTX表達相關基因能夠富集到Wnt信號通路中。WTX相關基因中與Wnt通路重疊基因有25個,提示W(wǎng)TX在肝癌中可能與Wnt通路相關。3、通過Western Blot方法驗證高表達WTX后,發(fā)現(xiàn)WTX高表達后β-catenin表達明顯下降,提示W(wǎng)TX發(fā)揮生物學作用的機制可能是通過降低β-catenin的表達,從而抑制Wnt通路,繼而發(fā)揮抑制肝癌細胞惡性生物學行為的能力。4通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn),WTX高表達后TCF的轉錄活性顯著下降,從而也證明Wnt通路被抑制。5高表達WTX同時再上調β-catenin,能夠使TCF的轉錄活性得到逆轉。結論:一,WTX基因在肝癌組織中呈低表達狀態(tài),并且與TNM分期顯著相關,WTX基因高表達的患者其預后明顯優(yōu)于低表達組。二,高表達WTX能夠抑制肝癌細胞的惡性生物學行為,高表達WTX能顯著抑制肝癌細胞體內(nèi)外的增殖和轉移能力;并且可以抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。低表達WTX能夠顯著增強肝癌細胞的增殖和侵襲遷移能力。三,WTX基因在肝癌組織中處于低表達狀態(tài),并且WTX表達相關基因能夠富集在Wnt通路上。WTX基因能夠降低β-catenin的表達,降低TCF家族的轉錄活性,從而抑制Wnt通路,繼而發(fā)揮抑制肝癌細胞惡性生物學行為的能力。WTX調控TCF家族的轉錄是依賴于β-catenin的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2356053