【摘要】：乳腺癌是女性多發(fā)惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的健康,其發(fā)病率逐年遞增,目前已躍居女性惡性腫瘤首位,成為女性腫瘤致死第二大原因。雖然近年來在乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及綜合治療等方面都獲得了很大的進步,但是,乳腺癌伴轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍增幅緩慢,目前針對乳腺癌患者的臨床治療方式還無法從根本上解決腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移問題。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜演變過程,然而截至目前乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機理仍未闡明,因此,改善乳腺癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量很大程度上依賴于對其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機理全面而深入的研究。MTDH蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài),尤其在乳腺癌細胞中MTDH異常積聚。MTDH蛋白與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),然而直至目前,其在腫瘤細胞中異常積聚的機理仍未闡明。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)MTDH蛋白在乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細胞中的多聚泛素化水平明顯低于正常人胚腎HEK293細胞,提示MTDH蛋白在乳腺癌細胞中的過表達是轉(zhuǎn)錄和降解兩方面失衡的結(jié)果,MTDH蛋白降解異�？赡苁瞧湓谌橄侔┘毎懈弑磉_及易轉(zhuǎn)移的主要原因之一。通過免疫共沉淀串聯(lián)質(zhì)譜分析篩選得到泛素連接酶FBXW7與MTDH蛋白之間存在相互作用,提示FBXW7可能是MTDH蛋白的特異性泛素連接酶。目的:為了探討泛素連接酶FBXW7與MTDH蛋白之間相互作用機制,(1)應(yīng)用免疫共沉淀及GST-Pulldown技術(shù)體內(nèi)外鑒定FBXW7與MTDH蛋白之間的相互作用關(guān)系;(2)探討不同亞型FBXW7對MTDH蛋白穩(wěn)定性影響;(3)探討FBXW7對MTDH蛋白泛素化水平的調(diào)控作用;(4)檢測FBXW7對MTDH蛋白半衰期的調(diào)控作用,希望闡明MTDH蛋白在乳腺癌細胞異常積聚的機理;(5)在乳腺癌細胞中探討FBXW7通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控MTDH蛋白降解,進而對乳腺癌細胞增殖、移行、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響。本課題有望最終闡明泛素連接酶FBXW7通過介導(dǎo)MTDH蛋白降解在乳腺癌細胞發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用,為發(fā)掘乳腺癌治療新靶點奠定理論基礎(chǔ)。方法:(1)首先構(gòu)建MTDH真核表達載體pcDNA-3.1-MTDH,轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA-MB-231,利用免疫共沉淀及液相串聯(lián)質(zhì)譜分析篩選乳腺癌細胞中MTDH蛋白相互作用蛋白;其次,分別以MTDH蛋白和FBXW7蛋白為誘餌蛋白進行免疫共沉淀,從正反兩方面驗證MTDH蛋白與泛素連接酶FBXW7之間的相互作用關(guān)系;最后利用原核表達系統(tǒng)表達并純化GST-FBXW7α蛋白,利用GST-Pulldown技術(shù)體外鑒定MTDH蛋白與泛素連接酶FBXW7之間相互作用關(guān)系。(2)首先,構(gòu)建FBXW7不同亞型真核表達載體p Flag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β、pFlag-CMV-FBXW7γ和FBXW7干涉載體p Slilencer4.1-shFBXW7,上述載體分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA-MB-231和正常人胚腎HEK293細胞,檢測FBXW7對MTDH蛋白穩(wěn)定性影響;其次,以MTDH蛋白為誘餌蛋白進行免疫共沉淀實驗,檢測在FBXW7過表達及干涉表達條件下MTDH蛋白泛素化水平變化情況;最后,用蛋白合成抑制劑放線菌酮分別處理FBXW7過表達和干涉表達細胞,檢測MTDH半衰期,最終闡明FBXW7作為MTDH蛋白泛素連接酶調(diào)控MTDH蛋白降解機制。(3)FBXW7真核表達載體pcDNA-3.1-FBXW7α轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA-MB-231和SKBR3,通過MTT細胞增殖、細胞劃痕、Transwell、細胞凋亡檢測等實驗闡明FBXW7通過介導(dǎo)MTDH蛋白泛素化降解途徑對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:(1)首先,通過免疫共沉淀及液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析,篩選出乳腺癌MDA-MB-231細胞中MTDH相互作用蛋白11個,其中含有一個泛素連接酶FBXW7;其次,在乳腺癌MDA-MB-231細胞中,分別以MTDH和FBXW7為誘餌蛋白進行免疫共沉淀,從正反兩個方面證實了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之間存在相互作用;最后利用原核表達系統(tǒng)成功表達出GST-FBXW7融合蛋白,并利用GST-Pulldown實驗在體外進一步證實了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之間存在相互作用關(guān)系。(2)首先,成功構(gòu)建了FBXW7不同亞型真核表達載體pFlag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β和pFlag-CMV-FBXW7γ,轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞,發(fā)現(xiàn)FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ均能下調(diào)MTDH蛋白水平,其中以FBXW7α作用最明顯;成功構(gòu)建FBXW7干涉載體pSlilencer4.1-shFBXW7,轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細胞,發(fā)現(xiàn)干涉細胞內(nèi)源性FBXW7表達后,MTDH蛋白水平明顯上調(diào);其次,以MTDH為誘餌蛋白進行免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)FBXW7過表達組,MTDH蛋白泛素化水平顯著上調(diào),然而FBXW7干涉組,MTDH蛋白泛素化水平明顯下調(diào);最后,檢測FBXW7對MTDH蛋白半衰期影響,與陰性對照組相比,FBXW7過表達組細胞MTDH蛋白半衰期明顯縮短,從12小時縮短至6小時,然而FBXW7干涉組,MTDH基本不降解。(3)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細胞,MTDH蛋白呈高表達,FBXW7與MTDH蛋白表達呈負相關(guān),提示FBXW7介導(dǎo)的MTDH蛋白泛素化降解異�？赡苁荕TDH蛋白在乳腺癌細胞異常聚積的主要原因之一。乳腺癌細胞過表達FBXW7均能抑制細胞增殖、移行和侵襲能力,并誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡,然而MTDH蛋白可以在一定程度逆轉(zhuǎn)過表達的FBXW7對細胞生物學(xué)行為的影響,因此推斷FBXW7通過介導(dǎo)MTDH蛋白的泛素化降解而抑制乳腺癌細胞的惡性表型。結(jié)論:(1)體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)FBXW7與MTDH蛋白存在相互作用關(guān)系。(2)泛素連接酶FBXW7對MTDH蛋白豐度起到負調(diào)控作用,其中以FBXW7α作用最明顯。(3)FBXW7在細胞內(nèi)作為MTDH蛋白的泛素連接酶介導(dǎo)其泛素化;(4)蛋白半衰期檢測實驗發(fā)現(xiàn),FBXW7通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控MTDH蛋白降解,從而負向調(diào)控MTDH蛋白半衰期。(5)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細胞中,FBXW7與MTDH蛋白表達呈負相關(guān),提示FBXW7介導(dǎo)的MTDH蛋白泛素化降解異常可能是MTDH蛋白在乳腺癌細胞異常聚積的主要原因之一。(6)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細胞中,FBXW7通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控MTDH蛋白降解,從而抑制乳腺癌細胞增殖、移行和侵襲能力,促進乳腺癌細胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9
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本文編號：2353922