【摘要】：研究背景和目的惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)威脅人類生命健康的重大疾病。腫瘤難以治愈,致死率高,其核心原因就是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程,腫瘤干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、微小轉(zhuǎn)移灶都可能在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起到重要的作用。惡性腫瘤在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都伴隨著基因組的改變,因此對(duì)腫瘤進(jìn)行基因水平分析能更進(jìn)一步了解其分子特征和發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。然而這些在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用的腫瘤細(xì)胞或者轉(zhuǎn)移灶一般都由微量細(xì)胞組成,甚至以單個(gè)細(xì)胞形式存在,越來(lái)越多的研究也證明腫瘤細(xì)胞之間存在廣泛的異質(zhì)性,而傳統(tǒng)的生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究手段往往基于大量細(xì)胞進(jìn)行分析,在研究以上問(wèn)題時(shí)遇到瓶頸,對(duì)其基因組特征以及在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過(guò)程中的分子機(jī)制尚不明確。因此從單細(xì)胞層面才能更加準(zhǔn)確深刻地揭示腫瘤遺傳學(xué)的本質(zhì)特征。本課題研究將應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),建立常見(jiàn)腫瘤的腫瘤干細(xì)胞、微轉(zhuǎn)移、循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離、單細(xì)胞測(cè)序及生物信息學(xué)分析的方法;實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤患者腫瘤干細(xì)胞、腫瘤微轉(zhuǎn)移、外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的精確識(shí)別與分離,并對(duì)其基因組進(jìn)行深入分析,在單細(xì)胞水平探尋腫瘤干細(xì)胞、微轉(zhuǎn)移和循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)事件,揭示腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥的關(guān)鍵生物學(xué)機(jī)制,為最終實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)的個(gè)體化治療提供新的依據(jù)。研究方法1)通過(guò)熒光流式分選技術(shù)富集并分選新鮮肝癌組織肝癌干細(xì)胞,顯微鏡下挑選單個(gè)細(xì)胞。2)通過(guò)Cell Search?系統(tǒng)富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,熒光顯微鏡下挑選單個(gè)細(xì)胞。通過(guò)核分離技術(shù)分離冰凍原位腫瘤組織細(xì)胞核,顯微鏡下確認(rèn)熒光和形態(tài),將單個(gè)腫瘤細(xì)胞核挑出。3)通過(guò)多重退火和環(huán)化循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,全基因組文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序,分析單個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)變異。通過(guò)外顯子測(cè)序,分析單核苷酸變異。4)提取癌組織、相應(yīng)癌旁組織和血液樣本DNA,進(jìn)行外顯子測(cè)序,分析單核苷酸變異,通過(guò)定點(diǎn)PCR擴(kuò)增與Sanger測(cè)序,在單細(xì)胞樣品中驗(yàn)證突變位點(diǎn)。5)通過(guò)顯微切割技術(shù)精確獲取肝細(xì)胞肝癌病灶的腫瘤組織,并提取DNA。將不同病灶DNA進(jìn)行外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序,分析單核苷酸變異和拷貝數(shù)變化,Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變位點(diǎn)。研究結(jié)果1)肝癌組織中CD44+CD90+干細(xì)胞比例占所有細(xì)胞的0.5%,肝癌組織中,CD44+CD90+干細(xì)胞以及CD44-CD90-腫瘤細(xì)胞大范圍拷貝數(shù)變化一致,局部區(qū)域具有異質(zhì)性。2)肝癌干細(xì)胞的拷貝數(shù)變化在進(jìn)化過(guò)程中積累,根據(jù)肝癌干細(xì)胞中拷貝數(shù)變化模式,可以對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行分群。3)肝細(xì)胞肝癌單核苷酸變異特征以C:GA:T為主,同時(shí)發(fā)現(xiàn)COL14A1、PLCB4、ACY1等新的突變,其在肝細(xì)胞肝癌中的作用有待進(jìn)一步研究。4)10例肝細(xì)胞肝癌患者均發(fā)生Chr1q拷貝數(shù)擴(kuò)增,Chr4q和16q拷貝數(shù)缺失。5)結(jié)腸癌組織中原位腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化具有異質(zhì)性,循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化具有高度一致性,轉(zhuǎn)移灶組織拷貝數(shù)變化與循環(huán)腫瘤細(xì)胞相似。6)乳腺癌與胃癌中,來(lái)自同一病人的循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化具有高度一致性,前列腺癌中同一病人的循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化根據(jù)局部區(qū)域擴(kuò)增或者缺失可分為兩個(gè)不同亞群。7)不同癌種循環(huán)腫瘤細(xì)胞單核苷酸變異分析發(fā)現(xiàn)ECM相關(guān)基因突變富集。結(jié)論1)肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中拷貝數(shù)變化都存在異質(zhì)性;肝癌干細(xì)胞的進(jìn)化遵循漸進(jìn)模式,肝癌細(xì)胞是由不同進(jìn)化階段的肝癌干細(xì)胞分化而來(lái);肝癌中存在正常干細(xì)胞;目前根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD90分選肝癌干細(xì)胞并不具有特異性。2)肝細(xì)胞肝癌患者基因組變化具有復(fù)雜性,需要綜合考慮病人之間的異質(zhì)性,針對(duì)性地實(shí)施個(gè)體化治療。3)結(jié)腸癌原位腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化遵循漸進(jìn)進(jìn)化模式,而單核苷酸變異則是不規(guī)律的分散進(jìn)化,循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能來(lái)源于一群高度進(jìn)化的原位腫瘤細(xì)胞。大多數(shù)病人循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化具有高度一致性,病人間的循環(huán)腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)變化具有癌種差異性;循環(huán)腫瘤細(xì)胞中富集ECM相關(guān)基因的突變,推測(cè)其在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2347942