【摘要】：目的:中國(guó)食管癌的發(fā)生率約為13/10萬(wàn),其中80%以上是鱗癌患者。雖然針對(duì)食管癌發(fā)病機(jī)理和診斷治療開(kāi)展了大量的科學(xué)研究,在早期診斷和治療模式方面也取得了重要的突破和進(jìn)展,但是食管癌患者的5年生存率仍低于20%。其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是引起腫瘤發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素,腫瘤細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)EMT,從原發(fā)腫瘤中分離出來(lái),經(jīng)血流遷移至其他部位,然后發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)進(jìn)行定植和生長(zhǎng),達(dá)到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的。microRNA是一段長(zhǎng)約20個(gè)堿基的單鏈非編碼RNA,可以與其靶基因3’非翻譯區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá),或者直接降解靶基因的mRNA。在食管鱗癌中,我們首次發(fā)現(xiàn)miR-214在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-214的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),提示miR-214可能參與調(diào)控食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。CrkL(CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白)是Crk信號(hào)接頭蛋白家族中的一員,參與多個(gè)信號(hào)通路的傳導(dǎo),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外蛋白之間的各種反應(yīng)。諸多研究證實(shí)CrkL在細(xì)胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移、對(duì)病原體的應(yīng)答以及凋亡過(guò)程中均發(fā)揮作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞白血病和非小細(xì)胞肺癌中CrkL的表達(dá)均有上升。在我們的前期工作中,通過(guò)基因表達(dá)譜芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選可能與調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞EMT相關(guān)的miR-214靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)含miR-214潛在識(shí)別位點(diǎn)�；诖�,本研究擬探索miR-214-CrkL通路對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT的影響方法:本研究分為以下三個(gè)部分:1、通過(guò)qPCR檢測(cè)miR-214及CrkL在食管鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中mRNA水平上的表達(dá)。通過(guò)Western blot及免疫組化分別檢測(cè)CrkL在食管鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中蛋白水平上的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析miR-214及CrkL表達(dá)與食管鱗癌病人腫瘤的浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。2、通過(guò)miR-214模擬物/抑制物及相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109,確定轉(zhuǎn)染效率后檢測(cè)各組細(xì)胞中CrkL及EMT標(biāo)記物E鈣粘蛋白(Ecadherin)和N鈣粘蛋白(N-cadherin)在mRNA及蛋白層面表達(dá)水平的變化,并且通過(guò)Transwell和Wound-Healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。3、通過(guò)miR-214模擬物/pcDNA.CrkL共轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.Null作為對(duì)照,考察高表達(dá)Crk L能否消除miR-214對(duì)EMT的抑制作用,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)考察miR-214對(duì)CrkL的靶向抑制作用。結(jié)果:1、PCR結(jié)果表明食管鱗癌組織中的miR-214的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯降低(P0.05),而PCR及Western Blot的結(jié)果證實(shí)腫瘤組織中CrkL在mRNA及蛋白層面的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均明顯升高(P0.05)。miR-214的低表達(dá)和CrkL的高表達(dá)則提示腫瘤浸潤(rùn)深度更深(P=0.04,P=0.013)并且更加容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033,P=0.012)。2、在細(xì)胞層面上,通過(guò)miR-214模擬物/抑制物及相應(yīng)陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-214模擬物組中Crk L和N-cadherin在翻譯前后水平的表達(dá)均低于對(duì)照組(P0.05),而E-cadherin的表達(dá)卻明顯高于對(duì)照組(P0.05)。轉(zhuǎn)染miR-214抑制物組中CrkL和N-cadherin的表達(dá)均高于對(duì)照組(P0.05),而E-cadherin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P0.05)。同時(shí)Transwell和Wound-Healing實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-214模擬物的細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯低于對(duì)照組(P0.05),而轉(zhuǎn)染miR-214抑制物的細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯低于對(duì)照組(P0.05)。3、Eca-109細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.Crk L后,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214/pcDNA.Null為對(duì)照,經(jīng)PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組中Ecadherin的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P0.05),N-cadherin打的表達(dá)高于對(duì)照組(P0.05)。Transwell和Wound-Healing結(jié)果示相比于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組穿透基膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,遷移的速度明顯下降。熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)在Crk L的3’非翻譯區(qū)存在miR-214的結(jié)合位點(diǎn),表明miR-214對(duì)Crk L表達(dá)的靶向抑制作用。結(jié)論:miR-214在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá),而其潛在的下游調(diào)控蛋白Crk L卻高表達(dá),并且低表達(dá)的miR-214和高表達(dá)的CrkL預(yù)示著腫瘤浸潤(rùn)深度的加深和更多的陽(yáng)性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)。過(guò)表達(dá)miR-214后,CrkL和N-cadherin的表達(dá)下降,E-cadherin表達(dá)上升,且細(xì)胞的遷移及侵襲能力均有顯著下降。同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-214和Crk L后發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CrkL可以抵消miR-214對(duì)EMT的抑制作用,熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)也證實(shí)miR-214對(duì)CrkL表達(dá)的靶向抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2012年38期

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本文編號(hào)：2347245