【摘要】：目的:中國食管癌的發(fā)生率約為13/10萬,其中80%以上是鱗癌患者。雖然針對食管癌發(fā)病機理和診斷治療開展了大量的科學研究,在早期診斷和治療模式方面也取得了重要的突破和進展,但是食管癌患者的5年生存率仍低于20%。其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認為是引起腫瘤發(fā)生侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的重要因素,腫瘤細胞通過啟動EMT,從原發(fā)腫瘤中分離出來,經(jīng)血流遷移至其他部位,然后發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)進行定植和生長,達到遠處轉(zhuǎn)移的目的。microRNA是一段長約20個堿基的單鏈非編碼RNA,可以與其靶基因3’非翻譯區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達,或者直接降解靶基因的mRNA。在食管鱗癌中,我們首次發(fā)現(xiàn)miR-214在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織,同時發(fā)現(xiàn)miR-214的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān),提示miR-214可能參與調(diào)控食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。CrkL(CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白)是Crk信號接頭蛋白家族中的一員,參與多個信號通路的傳導,從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外蛋白之間的各種反應。諸多研究證實CrkL在細胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移、對病原體的應答以及凋亡過程中均發(fā)揮作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、胃癌、慢性粒細胞白血病和非小細胞肺癌中CrkL的表達均有上升。在我們的前期工作中,通過基因表達譜芯片結(jié)合生物信息學分析篩選可能與調(diào)控食管鱗癌細胞EMT相關(guān)的miR-214靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CT10激酶調(diào)節(jié)子樣蛋白的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)含miR-214潛在識別位點。基于此,本研究擬探索miR-214-CrkL通路對于食管鱗癌細胞發(fā)生EMT的影響方法:本研究分為以下三個部分:1、通過qPCR檢測miR-214及CrkL在食管鱗癌及對應癌旁組織中mRNA水平上的表達。通過Western blot及免疫組化分別檢測CrkL在食管鱗癌及對應癌旁組織中蛋白水平上的表達。統(tǒng)計分析miR-214及CrkL表達與食管鱗癌病人腫瘤的浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。2、通過miR-214模擬物/抑制物及相應的陰性對照轉(zhuǎn)染人食管鱗癌細胞株Eca-109,確定轉(zhuǎn)染效率后檢測各組細胞中CrkL及EMT標記物E鈣粘蛋白(Ecadherin)和N鈣粘蛋白(N-cadherin)在mRNA及蛋白層面表達水平的變化,并且通過Transwell和Wound-Healing實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞侵襲和遷移能力的變化。3、通過miR-214模擬物/pcDNA.CrkL共轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株,同時轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.Null作為對照,考察高表達Crk L能否消除miR-214對EMT的抑制作用,通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灴疾靘iR-214對CrkL的靶向抑制作用。結(jié)果:1、PCR結(jié)果表明食管鱗癌組織中的miR-214的表達相對于對照組明顯降低(P0.05),而PCR及Western Blot的結(jié)果證實腫瘤組織中CrkL在mRNA及蛋白層面的表達相對于對照組均明顯升高(P0.05)。miR-214的低表達和CrkL的高表達則提示腫瘤浸潤深度更深(P=0.04,P=0.013)并且更加容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033,P=0.012)。2、在細胞層面上,通過miR-214模擬物/抑制物及相應陰性對照分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-214模擬物組中Crk L和N-cadherin在翻譯前后水平的表達均低于對照組(P0.05),而E-cadherin的表達卻明顯高于對照組(P0.05)。轉(zhuǎn)染miR-214抑制物組中CrkL和N-cadherin的表達均高于對照組(P0.05),而E-cadherin的表達顯著低于對照組(P0.05)。同時Transwell和Wound-Healing實驗證實轉(zhuǎn)染miR-214模擬物的細胞的侵襲和遷移能力明顯低于對照組(P0.05),而轉(zhuǎn)染miR-214抑制物的細胞的侵襲和遷移能力明顯低于對照組(P0.05)。3、Eca-109細胞共轉(zhuǎn)染miR-214模擬物/pcDNA.Crk L后,同時轉(zhuǎn)染miR-214/pcDNA.Null為對照,經(jīng)PCR和Western Blot實驗檢測,實驗組中Ecadherin的表達明顯低于對照組(P0.05),N-cadherin打的表達高于對照組(P0.05)。Transwell和Wound-Healing結(jié)果示相比于對照組,實驗組穿透基膜的細胞數(shù)明顯減少,遷移的速度明顯下降。熒光素酶基因報告試驗證實在Crk L的3’非翻譯區(qū)存在miR-214的結(jié)合位點,表明miR-214對Crk L表達的靶向抑制作用。結(jié)論:miR-214在食管鱗狀細胞癌組織中低表達,而其潛在的下游調(diào)控蛋白Crk L卻高表達,并且低表達的miR-214和高表達的CrkL預示著腫瘤浸潤深度的加深和更多的陽性淋巴結(jié)個數(shù)。過表達miR-214后,CrkL和N-cadherin的表達下降,E-cadherin表達上升,且細胞的遷移及侵襲能力均有顯著下降。同時過表達miR-214和Crk L后發(fā)現(xiàn)高表達CrkL可以抵消miR-214對EMT的抑制作用,熒光素酶基因報告試驗也證實miR-214對CrkL表達的靶向抑制作用。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2012年38期

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本文編號：2347245