發(fā)布時(shí)間：2018-11-20 07:30

【摘要】：研究背景：食管癌是目前最常見的且對人類生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO報(bào)道,2012年全世界范圍內(nèi)食管癌新發(fā)病例約為45萬例,死亡病例約40萬例,且全球發(fā)病率最高的地區(qū)之一為亞洲東部。由此可見我國為食管癌高發(fā)地區(qū)。據(jù)最新的惡性腫瘤流行病學(xué)報(bào)告顯示,2012年我國大陸食管癌新發(fā)病例28.7萬例/年,在各類惡性腫瘤中排第五位；死亡病例21.1萬例/年,死亡率為15.58/10萬,在各類惡性腫瘤中排第四位,且與2011年水平基本持平。近年來盡管對食管癌的治療已經(jīng)充分引起研究者的重視,而且其診斷、治療等技術(shù)得到了不斷的進(jìn)步,但是由于部分食管癌患者存在早期轉(zhuǎn)移等原因,治療效果欠佳。常需手術(shù)治療結(jié)合化學(xué)藥物治療來改善患者預(yù)后。因此尋找有效、安全可靠的靶點(diǎn)藥物成為目前食管癌化學(xué)治療的熱點(diǎn)之一。棉酚作為一種植物化學(xué)物,在植物中天然存在且具有抗癌等作用。已有大量研究證實(shí),棉酚可以抑制多種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,但是鮮有關(guān)于食管癌細(xì)胞的研究。為此本研究將食管癌細(xì)胞系SEG-1作為研究對象,將醋酸棉酚和單醛棉酚對食管癌的作用進(jìn)行對比,以了解其對SEG-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響,探討棉酚在食管癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。隨后進(jìn)一步在食管癌動物模型體內(nèi)研究棉酚的作用,以探討棉酚在食管癌治療中的可行性。第一部分棉酚對人食管癌SEG-1細(xì)胞體外增殖抑制作用及其機(jī)制研究目的與方法1.本實(shí)驗(yàn)采用臺盼藍(lán)染色法觀察棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的抗增殖作用。2.本實(shí)驗(yàn)采用Wright-Giemsa染色、Hoechst33258熒光顯微鏡、透射電鏡檢查棉酚作用的食管癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、瓊脂糖凝膠電泳分析棉酚作用食管癌細(xì)胞后DNA有無梯狀帶型、流式細(xì)胞檢查細(xì)胞中DNA含量定量分析細(xì)胞凋亡情況等方法來了解棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。3.通過測定caspase-9、caspase-3活性及流式細(xì)胞儀分析Bcl-2、Bcl-xL在棉酚作用前后的表達(dá)變化,探討棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的作用機(jī)制。4.本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的細(xì)胞周期在棉酚干預(yù)前后的變化,探討棉酚對SEG-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果醋酸棉酚、單醛棉酚不同濃度對SEG-1細(xì)胞生長均存在不同程度的抑制作用,且與藥物濃度及作用時(shí)間密切相關(guān)。1μM醋酸棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用較弱。醋酸棉酚、單醛棉酚濃度達(dá)到10μM時(shí),SEG-1細(xì)胞生長被完全抑制,在培養(yǎng)72 h時(shí),細(xì)胞呈負(fù)生長狀態(tài)。當(dāng)濃度低于10μM時(shí),相同濃度下,單醛棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用明顯強(qiáng)于醋酸棉酚(P0.05)；當(dāng)濃度高于10μM時(shí),相同濃度下,單醛棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用弱于醋酸棉酚(P0.05)。單醛棉酚在SEG-1細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)的IC50值均低于醋酸棉酚(P0.05)。Wright-Giemsa染色普通光鏡觀察到SEG-1細(xì)胞經(jīng)0.1%DMSO處理后細(xì)胞,呈多變形,邊緣清晰,形態(tài)和狀態(tài)良好,細(xì)胞間排列緊密,規(guī)整有序,貼壁生長,有個(gè)別凋亡細(xì)胞。隨著棉酚劑量的增加,細(xì)胞形態(tài)改變明顯,細(xì)胞間隙逐漸增大,細(xì)胞數(shù)逐漸減少；胞體回縮變圓,胞漿內(nèi)空泡、漂浮樣改變細(xì)胞增多。Hoechst33258熒光顯微鏡可見正常細(xì)胞核呈彌散均勻的微弱藍(lán)色熒光。而經(jīng)單醛棉酚處理12h,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有濃染致密的顆粒狀強(qiáng)藍(lán)色熒光,細(xì)胞質(zhì)中并有凋亡小體散在分布。透射電鏡觀察到正常細(xì)胞線粒體較多,形態(tài)正常,核染色質(zhì)呈絮點(diǎn)狀,均勻分散；經(jīng)25μM單醛棉酚處理12h后,多數(shù)線粒體腫脹變圓,嵴結(jié)構(gòu)消失,內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、部分成塊；經(jīng)25μM單醛棉酚處理24 h后,大部分線粒體呈空泡狀,嵴結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均消失,細(xì)胞核變形,塊狀染色質(zhì)向核膜靠攏。瓊漿電泳分析可觀察到：DMSO處理組未出現(xiàn)DNA梯狀帶,DNA集中在加樣孔附近,未出現(xiàn)彌散,是基因組DNA的表現(xiàn)。而經(jīng)棉酚處理后出現(xiàn)梯狀條帶,說明棉酚能導(dǎo)致食管癌細(xì)胞DNA的片段化,能誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)DNA含量測定：在5μM、10μM、25μM醋酸棉酚和單醛棉酚處理24 h、48h時(shí)測定二倍體細(xì)胞比例,結(jié)果顯示醋酸棉酚和單醛棉酚,隨著濃度的增加,細(xì)胞的凋亡率逐漸升高(P0.05),而單醛棉酚在相同濃度相同處理時(shí)間情況下的細(xì)胞凋亡率明顯高于醋酸棉酚(P0.05)。細(xì)胞凋亡的酶學(xué)分析：兩種棉酚均可引起SEG-1細(xì)胞內(nèi)caspase-9、caspase-3活性升高,在處理后6h內(nèi)活性升高顯著,隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6hcaspase-9活性顯著高于單醛棉酚,而在處理后18h、24h明顯低于單醛棉酚,說明醋酸棉酚在處理后早期caspase-9活性升高快,但6h后降得也快,而單醛棉酚處理6h后caspase-9活性下降較慢；caspase-3活性在處理后12h內(nèi)活性升高顯著,隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6h、12h時(shí)caspase-3活性顯著高于單醛棉酚,而在處理后18 h、24 h明顯低于單醛棉酚。Bcl-2家族蛋白分析：醋酸棉酚和單醛棉酚處理后Bc1-2、Bcl-xL表達(dá)水平明顯降低,以DMSO處理的Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量設(shè)定為100%,醋酸棉酚處理組Bcl-2表達(dá)量下降69.4%,單醛棉酚處理組Bcl-2表達(dá)量下降70.8%；醋酸棉酚處理組Bcl-xL表達(dá)量下降54.0%,單醛棉酚處理組Bcl-xL表達(dá)量下降39.5%。細(xì)胞周期分析：應(yīng)用不同濃度的醋酸棉酚或單醛棉酚處理SEG-1細(xì)胞24h后,細(xì)胞周期變化較小,但當(dāng)處理時(shí)間延長至48h后,SEG-1細(xì)胞有不同程度的G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,對G2期影響較小,提示醋酸棉酚能使食管癌細(xì)胞停滯在G1期,細(xì)胞進(jìn)入增殖期減少,DNA合成速度減慢。醋酸棉酚25μM處理48h后因亞二倍體或碎片細(xì)胞增多,影響周期分析,因此未對該濃度處理的細(xì)胞進(jìn)行分析。而單醛棉酚則使食管癌細(xì)胞G2期細(xì)胞的增多,G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞無明顯影響,提示單醛棉酚主要使食管癌細(xì)胞停滯在G2期,抑制其增殖。單醛棉酚25μM處理48h的細(xì)胞周期分布與DMSO對照組比較無明顯差異結(jié)論1.棉酚可有效抑制食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的增殖,且存劑量-時(shí)間效應(yīng)。而單醛棉酚的作用強(qiáng)于醋酸棉酚。2.棉酚可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的凋亡,且存劑量-時(shí)間效應(yīng),單醛棉酚的誘導(dǎo)凋亡作用強(qiáng)于醋酸棉酚。這種作用可能與caspase-9、caspase-3的激活及Bcl-2、 Bcl-xL表達(dá)降低相關(guān)。3.棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,醋酸棉酚、單醛棉酚可分別使細(xì)胞阻滯在G1期、G2期。第二部分棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞裸鼠模型體內(nèi)作用的研究目的與方法探討棉酚在食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞裸鼠模型體內(nèi)的作用。取健康SPF級BALb/c雌性裸鼠30只,分為6組,即醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組、空白對照組、陰性對照組,每組5只,空白組未接種及棉酚處理,其余5組均接種SEG-1細(xì)胞,醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組分別在接種腫瘤后第3天給予相應(yīng)劑量棉酚處理,觀察各組腫瘤體積和重量的變化,計(jì)算腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延遲時(shí)間,觀察裸鼠接種后體重變化,解剖測量肝、脾重量的變化。結(jié)果一般情況：裸鼠在接種前生活狀態(tài)始終正常、食欲旺盛、行動自如。皮下接種SEG-1細(xì)胞1×107個(gè)細(xì)胞后第1天即出現(xiàn)精神萎靡、飲食不振、體毛聳立等癥狀,繼而行動遲緩直至死亡。裸鼠在接種細(xì)胞第4天時(shí)皮下出現(xiàn)肉眼可見的明顯腫塊,腫塊逐漸增大,裸鼠存活時(shí)間為(13.0±1.0)天。死亡后解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤灶與周圍組織粘連,部分裸鼠腹腔有腹水,肝脾腫大。腫塊解剖后制作成細(xì)胞懸液,染色后于顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與SEG-1細(xì)胞一致。病理檢查：醋酸棉酚40mg/kg組代表給藥組腫瘤與陰性對照組裸鼠的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行病理對照。給藥組腫瘤大小及浸潤范圍均小于陰性對照組,腫瘤分化稍好于陰性對照組,腫瘤血管形成較陰性對照組差。腫瘤生長變化：各給藥組裸鼠皮下腫塊均出現(xiàn)不同程度的縮小、腫塊生長速度減慢。腫瘤生長抑制率：醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組分別為14.3%、31.2%、33.7%、32.9%(P0.05),醋酸棉酚40mg/kg組腫瘤生長延遲天數(shù)比醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組少1天。陰性對照組裸鼠接種SEG-1細(xì)胞后13天后體重顯著超過未接種SEG-1細(xì)胞的裸鼠。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后第1天開始出現(xiàn)活動減少,逐漸消瘦,醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠體重在用藥第5天開始顯著低于陰性對照組,醋酸棉酚40mg/kg組裸鼠體重在用藥第6天開始顯著低于陰性對照組。單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后體重變化與陰性對照組基本一致。棉酚對裸鼠肝、脾重量及生存期的影響：在接種腫瘤后第10天、死亡時(shí)解剖裸鼠發(fā)現(xiàn),未接受棉酚干預(yù)的陰性對照組裸鼠肝臟較正常裸鼠肝臟明顯增重,說明SEG-1腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移；給予40mg/kg醋酸棉酚干預(yù)的接種裸鼠肝臟重量明顯低于陰性對照組,而給予40mg/kg或60mg/kg甲醛棉酚干預(yù)的裸鼠肝臟較對照組并沒有減輕。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠生存時(shí)間明顯短于陰性對照組。醋酸棉酚雖有良好的抗腫瘤作用,但同時(shí)也使裸鼠生存時(shí)間縮短,說明醋酸棉酚毒性作用比單醛棉酚大。而單醛棉酚在確保較強(qiáng)的抗腫瘤作用的同時(shí),無明顯的毒副作用,可延長裸鼠的生存期。結(jié)論1.醋酸棉酚、單醛棉酚均能抑制食管癌細(xì)胞系SEG-1裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長。2.單醛棉酚對裸鼠模型的毒性作用比醋酸棉酚小。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2344253