【摘要】：背景:肝癌是高致死率腫瘤,常伴有肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移,并且預(yù)后較差,復(fù)發(fā)率高,較難治愈。Hca-P是小鼠肝癌細(xì)胞,并具有低(約25%)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率,是肝癌淋巴道起始轉(zhuǎn)移研究的理想細(xì)胞模型。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)指的是一類長度超過200 bp、不能編碼或具有極弱編碼能力的一類RNA。lnc RNA能夠影響基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)修飾等過程,還能影響癌癥的預(yù)后及耐藥性。lnc RNA能夠與mi RNA結(jié)合,調(diào)節(jié)其作用靶點,改變生理過程。本課題組前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)NONMMUT045874在Hca-P細(xì)胞中的表達(dá)是其在與Hca-P細(xì)胞具有相同的遺傳背景、但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為75%的Hca-F細(xì)胞中的49.3%,這提示我們NONMMUT045874可能與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān),但目前還未見相關(guān)報道。本課題組在腎癌實體組織及白血病骨髓單個核細(xì)胞樣本中檢測了長鏈非編碼RNA NONHSAT021545(其序列包含NONMMUT045874和mmu-mi R-330-3p潛在結(jié)合位點),發(fā)現(xiàn)其與has-mi R-330-3p的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。本研究通過上調(diào)NONMMUT045874表達(dá)水平,研究其對Hca-P細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響,并探究其與mmu-mi R-330-3p的內(nèi)在聯(lián)系。目的:1.瞬時轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-NONMMUT045874質(zhì)粒至Hca-P,q RT-PCR法檢測NONMMUT045874的表達(dá)水平;2.探究NONMMUT045874過表達(dá)對Hca-P體外增殖、遷移和侵襲能力的影響;3.探究NONMMUT045874表達(dá)水平變化對Hca-P的EMT行為的影響;4.研究NONMMUT045874與mmu-mi R-330-3p之間的靶向調(diào)控作用,為深入研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。方法:1.根據(jù)NONMMUT045874全長序列以及pc DNA3.1/V5-His B表達(dá)載體多克隆位點區(qū)設(shè)計引物對并擴(kuò)增全長;2.PCR產(chǎn)物純化后與p EASY-blunt simple克隆載體連接,獲得p EASY-blunt simple-NONMMUT045874克隆質(zhì)粒;3.將克隆質(zhì)粒、pc DNA3.1/V5-His B空質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,純化后連接,獲得pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表達(dá)質(zhì)粒;4.使用LipofectamineTM2000將pc DNA3.1-NONMMUT045874以及pc DNA 3.1空載體轉(zhuǎn)染至Hca-P,轉(zhuǎn)染48小時后,q RT-PCR法檢測NONMMUT045874過表達(dá)水平;5.Transwell小室法檢測NONMMUT045874過表達(dá)對Hca-P體外遷移及侵襲能力的影響;6.臺盼藍(lán)計數(shù)法檢測NONMMUT045874過表達(dá)對Hca-P體外增殖能力的影響;7.q RT-PCR法檢測NONMMUT045874過表達(dá)對Hca-P的EMT行為的影響;8.分別構(gòu)建NONMMUT045874與mmu-mi R-330-3p結(jié)合位點野生型與突變型雙熒光素表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至Hca-P,檢測熒光素酶活力的變化;9.Transwell法檢測mmu-mi R-330-3p與NONMMUT045874之間的關(guān)系。結(jié)果:1.構(gòu)建了pEASY-blunt simple-NONMMUT045874克隆質(zhì)粒和pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表達(dá)質(zhì)粒;2.q RT-PCR結(jié)果表明,與pc DNA3.1組細(xì)胞相比,在pc DNA3.1-NONMMUT045874組細(xì)胞的NONMMUT045874表達(dá)水平上升了4323倍(p=0.0004);3.與對照組相比,NONMMUT045874過表達(dá)使Hca-P體外遷移能力增加了120.0%(p=0.0119),侵襲能力提升了78.9%(p=0.0012);4.與對照組相比,NONMMUT045874過表達(dá)使Hca-P細(xì)胞中Twist1和Twist 2的表達(dá)水平分別升高了1110%(p=0.00007)和100%(p=0.007),E-cadherin表達(dá)水平降低了39%(p=0.027);5.NONMMUT045874和mmu-mi R-330-3p二者靶向結(jié)合,mmu-mi R-330-3p靶向負(fù)調(diào)控NONMMUT045874對Hca-P細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)。結(jié)論:1.pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表達(dá)質(zhì)粒使NONMMUT045874在Hca-P中過表達(dá);2.NONMMUT045874過表達(dá)增強(qiáng)Hca-P細(xì)胞體外遷移和侵襲能力,不影響Hca-P增殖;3.NONMMUT045874過表達(dá)引起Twist1和Twist2表達(dá)水平升高,E-cadherin表達(dá)水平降低,促進(jìn)Hca-P體外轉(zhuǎn)移能力;4.mmu-mi R-330-3p靶向負(fù)調(diào)控NONMMUT045874對肝癌Hca-P細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)作用。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2343255