【摘要】：目的:人停滯缺陷蛋白1(human arrest defective 1,hARD1)是一種N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase,NAT),在體內(nèi)催化多種蛋白質(zhì)乙�；�;經(jīng)研究,hARD1與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤密切相關(guān),成為近年來腫瘤診治的新思路及研究熱點之一。本實驗通過用過表達重組質(zhì)粒pCMV6-Entry-ARD1轉(zhuǎn)染人大腸腺癌細(xì)胞株SW620,建立hARD1穩(wěn)定過表達的大腸腺癌細(xì)胞系,觀察大腸腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡變化情況,并測定細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達水平及蛋白質(zhì)表達水平,通過對比探討hARD1過表達后對大腸癌細(xì)胞凋亡因子的影響。方法:1.大腸癌SW620細(xì)胞株的復(fù)蘇與培養(yǎng);2.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)和G418細(xì)胞篩選法,將重組質(zhì)粒pCMV6-Entry-ARD1導(dǎo)入SW620大腸癌細(xì)胞株,構(gòu)建hARD1過表達的穩(wěn)定細(xì)胞系并通過QPCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染情況;同法將空載質(zhì)粒導(dǎo)入SW620大腸癌細(xì)胞株,構(gòu)建陰性對照組。3.采用流式細(xì)胞術(shù)對實驗組、空白對照組及陰性對照組進行細(xì)胞周期的檢驗;4.Annexin/PI染色檢測三組細(xì)胞凋亡情況;5.EDU法檢測實驗組、空白對照組及陰性對照組三組細(xì)胞增殖情況;6.應(yīng)用Q-PCR、Western blot法檢測三組細(xì)胞中TNF-α、Fas、caspase-8及BcL-2在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的表達情況;結(jié)果:1.SW620大腸癌細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)成功且生長良好;2.經(jīng)G418試劑成功篩選出hARD1穩(wěn)定過表達的大腸癌細(xì)胞系;經(jīng)Q-PCR檢測實驗組、空白對照組及陰性對照組三組細(xì)胞ARD1相對表達量分別為:4.23±0.11、0.82±0.04及1 ±0.04,經(jīng)方差分析實驗組ARD1表達上升和陰性對照組及空白對照組比較(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,陰性對照組和空白對照組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明ARD1在實驗組中mRNA水平高表達;Western blot檢測三組細(xì)胞ARD1蛋白質(zhì)水平表達量提示:實驗組1.60±0.02,陰性對照組0.81 ±0.02,空白對照組1 ±0.02,數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析實驗組ARD1表達上升和陰性對照組及空白對照組比較(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,陰性對照組和空白對照組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明ARD1在實驗組中蛋白水平表達增高;經(jīng)上述檢測表明hARD1過表達細(xì)胞系構(gòu)建成功。3.細(xì)胞周期檢測提示:G0/G1期細(xì)胞:空白對照組占53.0%,實驗組占51.8%,陰性對照組占52.4%;S期細(xì)胞:空白對照組占17.3%,實驗組占13.0%,陰性對照組占16.4%;G2/M期細(xì)胞:空白對照組占18.0%,實驗組占20.1%,陰性對照組占18.9%;三組細(xì)胞的細(xì)胞周期經(jīng)卡方檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.細(xì)胞凋亡檢測提示:實驗組細(xì)胞凋亡水平為1.9%,空白對照組細(xì)胞凋亡水平為8.8%,陰性對照組細(xì)胞凋亡水平為8.6%。實驗組分別與另外兩組數(shù)據(jù)進行比較(P0.05)差異學(xué)有統(tǒng)計學(xué)意義,空白組與陰性對照組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明實驗組細(xì)胞凋亡率下降有意義。5.EDU檢測提示:實驗組細(xì)胞增殖水平為41%,空白對照組細(xì)胞增殖水平為28.3%,陰性對照組細(xì)胞增殖水平為25%,對三組細(xì)胞增殖水平檢測進行卡方檢驗,實驗組增殖升高和陰性對照組及空白組比較(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,陰性對照組和空白組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6.凋亡途徑相關(guān)因子mRNA表達水平檢測提示:TNF-α表達水平下降,實驗組和空白對照組及陰性組比較(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,空白對照組和陰性對照組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;Fas、caspase-8、BCL-2在三組細(xì)胞間的表達水平經(jīng)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。蛋白質(zhì)表達水平檢測提示:Fas在三組細(xì)胞間的表達水平經(jīng)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),TNF-α、caspase-8表達下降,實驗組和空白對照組及陰性組比較(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,空白對照組和陰性對照組比較(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;BCL-2表達上調(diào),實驗組和空白對照組及陰性組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.本實驗表明人大腸癌SW620細(xì)胞過表達hARD1后大腸癌細(xì)胞凋亡減少、增殖增多、細(xì)胞周期無明顯變化;說明hARD1可以降低大腸癌細(xì)胞凋亡和促進大腸癌細(xì)胞的增殖。2.人大腸癌SW620細(xì)胞過表達hARD1后凋亡因子TNF-α在mRNA水平和蛋白水平表達下降、caspase-8在蛋白水平表達下降、BcL-2在蛋白水平表達上升;說明hARD 1可能通過促進或抑制多個凋亡因子的表達而抑制大腸癌細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：2341454