【摘要】：第一部分HSP90抑制劑在TALL中靶向NOTCH1的機(jī)制和功能研究目的：急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是一種常見(jiàn)的兒童癌癥,嚴(yán)重威脅未成年人群的生命和健康。其中,T細(xì)胞ALL (T-ALL)的治療仍舊比較困難,尚無(wú)靶向藥物。NOTCH1是T-ALL病理過(guò)程中的重要癌基因,抑制NOTCH1可抑制T-ALL細(xì)胞增殖。然而,現(xiàn)有的NOTCH1阻斷劑(γ-分泌酶抑制劑)產(chǎn)生明顯的耐藥性和不良反應(yīng),進(jìn)一步研發(fā)替代的NOTCH 1靶向治療策略對(duì)T-ALL的有效治療至關(guān)重要。本研究旨在闡明HSP90抑制劑阻斷NOTCH1信號(hào)通路的分子機(jī)制,并在體內(nèi)外評(píng)價(jià)藥物對(duì)T-ALL的抑制作用,為HSP90抑制劑用于治療T-ALL提供依據(jù)。方法：采用免疫印跡(Western blot)及熒光定量PCR (Real-Time PCR)的方法檢測(cè)HSP90抑制劑對(duì)NOTCH 1蛋白水平及下游靶基因表達(dá)的影響：利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)確定HSP90與NOTCH1的相互作用及HSP90抑制劑誘導(dǎo)NOTCH1的泛素化進(jìn)程;細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)及凋亡檢測(cè)評(píng)價(jià)HSP90抑制劑對(duì)多種T-ALL細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響：繼而利用小鼠異源移植(xenograft) T-ALL模型考察HSP90抑制劑體內(nèi)抗白血病的療效。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)HSP90抑制劑在多種T-ALL細(xì)胞中明顯抑制NOTCH1的激活形式ICN1 (intracellular NOTCH1),同時(shí)下調(diào)Hes1、c-Myc等經(jīng)典的NOTCH1下游靶基因表達(dá);進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)HSP90與ICN1直接相互結(jié)合,并定位其結(jié)合位點(diǎn)為ICN1的PEST結(jié)構(gòu)域;此外HSP90抑制劑能夠促進(jìn)ICN1泛素化,迅速降解這一癌基因蛋白；體外實(shí)驗(yàn)顯示HSP90抑制劑阻遏多種T-ALL細(xì)胞生長(zhǎng)增殖并促進(jìn)凋亡,而且藥物在體內(nèi)可以有效緩解T-ALL模式小鼠的脾臟腫大現(xiàn)象(p0.0001)及骨髓(p0.01)、脾臟(p0.0001)的白血病細(xì)胞比例。結(jié)論：我們的數(shù)據(jù)證實(shí)NOTCH1是HSP90的新靶點(diǎn),抑制HSP90的活性可以促進(jìn)NOTCH1泛素化和降解,提示了NOTCH1蛋白穩(wěn)態(tài)調(diào)控的新機(jī)制。同時(shí)臨床前的研究結(jié)果也為HSP90抑制劑用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療提供了重要研究基礎(chǔ)。第二部分多壁碳納米管抑制caco-2細(xì)胞表面Pgp和MRP4外排功能的機(jī)制研究目的：腫瘤細(xì)胞膜表面主動(dòng)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)是引起腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一。其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族蛋白作為經(jīng)典的外排蛋白,高表達(dá)于癌細(xì)胞膜表面可以促進(jìn)化療藥物外排,減少其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,引起癌細(xì)胞耐藥。課題前期研究發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管(MWCNTs)可以抑制ABC家族蛋白重要成員P-糖蛋白(Pgp)及多藥耐藥相關(guān)蛋白4(MRP4)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,但是機(jī)制尚不清楚,因此本課題旨在探討MWCNTs引起Pgp和MRP4外排功能降低的分子機(jī)制,從而為以MWCNTs為載體的抗腫瘤多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立提供科學(xué)依據(jù)。方法：研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析caco-2細(xì)胞對(duì)Pgp底物羅丹明123(R123)及MRP4底物熒光素(fluorescein)的攝取和外排,以此表征MWCNTs作用對(duì)Pgp和MRP4的外排功能的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time qPCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)方法分析MWCNTs處理對(duì)caco-2細(xì)胞Pgp及MRP4轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯的影響;采用免疫熒光標(biāo)記(Immunofluorescent labling)與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的方法檢測(cè)MWCNTs對(duì)caco-2細(xì)胞膜表面Pgp及MRP4膜分布的影響；通過(guò)掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察MWCNTs與caco-2細(xì)胞膜的相互作用及其在細(xì)胞內(nèi)的定位。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法探討Pgp及MRP4的上游調(diào)控因子c-Myc發(fā)揮的介導(dǎo)作用。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)1)MWCNTs抑制P-gp和MRP4的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性；2)MWCNTs抑制P-gp和MRP4的轉(zhuǎn)錄、翻譯及膜分布：3)MWCNTs同時(shí)抑制c-Myc的轉(zhuǎn)錄及翻譯;4)過(guò)表達(dá)c-Myc可以挽救MWCNTs對(duì)P-gp和MRP4基因表達(dá)的抑制;5)MWCNTs與caco-2細(xì)胞膜相互作用并能進(jìn)入細(xì)胞定位于胞內(nèi)囊泡狀結(jié)構(gòu)中;6)MWCNTs可以增加caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生并引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；7)抗氧化物質(zhì)不能抵抗MWCNTs對(duì)P-gp和MRP4的抑制作用。結(jié)論：結(jié)果提示MWCNTs可以抑制caco-2內(nèi)Pgp及MRP4的基因表達(dá)；MWCNTs通過(guò)抑制癌基因c-Myc的表達(dá)來(lái)阻遏Pgp和MRP4的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯,進(jìn)而抑制其外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.71

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本文編號(hào)：2337598