【摘要】：背景與目的肺腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤,2011年IASLC/ATS/ERS國際肺腺癌新分類將肺實體為主型腺癌伴黏液產(chǎn)生(SPAC)歸為浸潤性肺腺癌的一種獨立病理類型,該分類系統(tǒng)中SPAC包括肺實體為主型腺癌伴粘液產(chǎn)生及伴有粘液的完全性實體型腺癌兩種類型。關(guān)于這兩種類型實體型腺癌的共性和差異性目前尚無定論。最近,病理學家們發(fā)現(xiàn)部分肺大細胞癌(LCC)的臨床病理特征及免疫表型與伴有粘液的完全性實體型腺癌難以區(qū)分,提出應將這類LCC重新分類為寡黏液的完全性實體型腺癌。因此,肺實體型腺癌可能包括實體為主型腺癌伴粘液產(chǎn)生、伴有黏液的完全性實體型腺癌和寡黏液的完全性實體型腺癌等一系列形態(tài)學譜系。目前對肺實體型腺癌的臨床病理特征、分子學改變、預后及發(fā)病機制缺乏深入研究。我們前期應用高通量全基因組表達譜芯片分析技術(shù)對比了肺實體型腺癌、經(jīng)典型肺腺癌以及相應正常肺組織中的基因表達譜,發(fā)現(xiàn)肺實體型腺癌中差異性表達最明顯的下調(diào)靶基因—LKB1和BRGl。LKB1是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的腫瘤抑制基因,在抑制細胞增殖、誘導細胞極性、調(diào)控細胞能量代謝及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面有重要作用。BRG1是依賴ATP酶的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復合物的核心亞基,參與胚胎發(fā)育、組織再生、細胞周期調(diào)控和腫瘤的分化與增殖,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前LKB1和BRG1在肺實體型腺癌的表達研究未見有文獻報道。本課題將首次全面系統(tǒng)地對肺實體型腺癌進行系統(tǒng)性研究,旨在(1)進一步明確肺實體型腺癌,特別是寡粘液的完全性實體型腺癌的病理診斷標準；(2)明確肺實體型腺癌的臨床病理特征、免疫表型和分子學改變,并確證肺實體型腺癌的獨立預后因素；(3)明確LKB1和BRG1在肺實體型腺癌中的表達情況；(4)明確LKB1和BRG1在肺實體型腺癌中表達缺失的分子機制。材料與方法收集2003年1月～2013年12月期間病理診斷為肺實體型腺癌、低分化腺癌以及大細胞癌的肺癌手術(shù)切除標本共248例,應用光鏡觀察、AB/PAS組織化學染色、免疫組化等方法篩選肺實體型腺癌病例并對其進行組織學亞型分型。進一步收集所有肺實體型腺癌患者的完整臨床資料并隨訪。應用DNA直接測序、免疫組化、FISH等方法評估EGFR、KRAS及ALK基因狀態(tài)。收集7例肺腺癌及相應正常肺組織的新鮮標本,其中4例為肺實體型腺癌,3例為經(jīng)典型肺腺癌,分別提取總RNA,應用NimbleGen基因芯片對各例肺腺癌組織及正常肺組織進行基因表達譜分析,篩選出肺實體型腺癌中差異性表達最明顯的下調(diào)靶基因—LKB1和BRG1,并采用免疫組化方法檢測肺實體型腺癌、經(jīng)典型肺腺癌及正常肺組織中LKB1和BRG1蛋白表達情況,分析其表達與肺實體型腺癌患者各項臨床病理學參數(shù)、EGFR、KRAS和ALK基因狀態(tài)及其預后的關(guān)系。選取LKB1和BRG1蛋白表達缺失的肺實體型腺癌病例,應用DNA直接測序、FISH和甲基化特異性PCR等方法,進一步研究LKB1和BRG1在肺實體型腺癌中的缺失機制。結(jié)果1.肺實體型腺癌的臨床病理特征106例肺實體型腺癌患者中男女比為4.9：1,年齡32-84歲(平均58.6歲),69例(65.1%)患者有吸煙史。按照第7版TNM分期標準,Ⅰ期27例(25.5%),Ⅱ期33例(31.1%),Ⅲ期43例(40.6%),Ⅳ期3例(2.8%)。44例(41.5%)有腫瘤內(nèi)脈管侵犯、40例(37.7%)有臟層胸膜侵犯、61例(57.5%)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。26例(24.5%)有遠處轉(zhuǎn)移,31例(29.2%)術(shù)后復發(fā)。肺實體型腺癌與經(jīng)典型肺腺癌在性別、吸煙史、腫瘤最大徑、脈管侵犯、胸膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、復發(fā)及臨床分期之間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與經(jīng)典型肺腺癌相比,肺實體型腺癌更多見于男性吸煙、腫瘤最大徑4.5cm、伴有脈管侵犯/胸膜侵犯／淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移／遠處轉(zhuǎn)移及高臨床分期的患者。肺實體型腺癌的三種不同組織學亞型在性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤最大徑、脈管侵犯、胸膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、復發(fā)及臨床分期之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.肺實體型腺癌的組織學特征按照肺實體型腺癌的主要病理學特征,106例肺實體型腺癌進一步分為實體為主型腺癌伴黏液產(chǎn)生41例、伴有黏液的完全性實體型腺癌23例、寡黏液的完全性實體型腺癌42例。(1)實體為主型腺癌伴黏液產(chǎn)生(SPAC)腫瘤以實性片狀生長為主,實性區(qū)域缺乏貼壁、腺泡、乳頭、微乳頭等可辨認的腺癌結(jié)構(gòu)。實性區(qū)腫瘤細胞AB/PAS染色陽性。多數(shù)病例腫瘤細胞呈多角形,伴有不同程度異型性,核分裂活性較低。部分病例腫瘤細胞呈大細胞、嗜酸細胞、印戒細胞或幾種細胞形態(tài)混合存在。在SPAC實體性成分的外圍常常含有貼壁、腺泡、篩狀、乳頭、微乳頭等可明確辨認的腺癌結(jié)構(gòu)。(2)伴有粘液的完全性實體型腺癌腫瘤呈完全的實體性生長結(jié)構(gòu)。腫瘤細胞AB/PAS染色陽性。多數(shù)病例腫瘤細胞呈多角形,伴有不同程度異型性,核分裂像1～6個/10HPF。部分病例腫瘤細胞呈大細胞、嗜酸細胞、印戒細胞或幾種細胞形態(tài)混合存在,其中3例幾乎全部由印戒細胞組成。(3)寡粘液的完全性實體型腺癌 腫瘤表現(xiàn)為完全的實體巢狀或片狀結(jié)構(gòu)。腫瘤細胞AB/PAS染色陰性。大部分病例腫瘤細胞呈多角形,常伴有不同程度異型性,核染色質(zhì)呈空泡狀,可見明顯核仁,核分裂活性較高。部分病例腫瘤細胞主要由透明細胞(5例)、橫紋肌樣細胞(2例)、基底樣細胞(1例)或嗜酸細胞(1例)組成。3.肺實體型腺癌的免疫組化特征肺實體型腺癌中,TTF-1、NapsinA的表達率分別為67.9%和66.0%,均明顯低于經(jīng)典型肺腺癌病例組(P0.05),而CK7表達在兩組之間的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。肺實體型腺癌與經(jīng)典型肺腺癌兩組病例Ki 67增殖指數(shù)之間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。三種不同組織學亞型肺實體型腺癌中TTF-1、NapsinA、CK7表達的陽性率及Ki67增殖指數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。所有106例肺實體型腺癌病例中p40、DSC3、CgA、CD56均為陰性。4.肺實體型腺癌的分子學改變106例肺實體型腺癌中,7.5%(8/106)檢測出EGFR突變,主要為E19框內(nèi)缺失突變(62.5%,5/8)和E21點突變(37.5%,3/8)；30.2% (32/106)檢測出KRAS突變,主要為12號密碼子突變(90.6%,29/32)；8.5% (9/106)存在ALK基因重排。三種不同組織學亞型肺實體型腺癌中EGFR突變率、KRAS突變率及ALK基因重排陽性率之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)5.肺實體型腺癌中LKB1和BRG1蛋白表達及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系LKB1和BRG1在肺實體型腺癌中的表達率明顯低于經(jīng)典型肺腺癌和正常肺組織(P0.001)。106例肺實體型腺癌中,45例(42.5%)LKB1蛋白表達缺失,33例(31.1%)BRG1蛋白表達缺失。LKB1和BRG1在不同組織學亞型肺實體型腺癌中的表達缺失率無明顯差異(P0.05)。在LKB1和BRG1陰性病例中,20.8%(22/106)同時存在LKB1和BRG1表達缺失,LKB1表達缺失與BRG1表達缺失呈正相關(guān)。LKB1在吸煙、有脈管侵犯/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ、高增殖指數(shù)的患者中的表達缺失率明顯高于對照組(P0.05)。BRG1在有脈管侵犯/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移/復發(fā)、臨床分期Ⅲ～Ⅳ及高增殖指數(shù)的患者中的表達缺失率明顯高于對照組(P0.05)。LKB1和BRG1在TTF-1、NapsinA、CK7陰性組的缺失率明顯高于TTF-1、NapsinA、CK7陽性組(P0.05)。LKB1在KRAS突變型病例組的表達缺失率明顯高于KRAS野生型病例組(P0.05)。BRG1在EGFR野生型病例組的表達缺失率明顯高于突變型病例組(P0.05)。6.肺實體型腺癌的預后分析106例肺實體型腺癌患者中,75例(70.8%)患者獲得隨訪資料,生存時間3～78.8月(平均27.4月)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示腫瘤體積大、伴有脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、復發(fā)、高臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、TTF-1陰性、NapsinA陰性、LKB1表達缺失、BRG1表達缺失及Ki67增殖指數(shù)高的患者預后較差。COX多因素分析顯示遠處轉(zhuǎn)移、TTF-1陰性、NapsinA陰性、LKB1表達缺失及BRG1表達缺失為影響肺實體型腺癌患者預后的獨立危險因素。7.LKB1和BRG1陰性肺實體型腺癌的基因測序及FISH檢測結(jié)果本研究應用基因測序及FISH方法,探討LKB1和BRG1缺失的機制,發(fā)現(xiàn)：21.4% (9/42)的LKB1陰性肺實體型腺癌存在LKBl基因突變,其中4例為移碼突變、5例為同義突變,57.5%(23/40)存在LKB1基因缺失或單倍體改變,59.5%(25/42)至少存在一項LKB1基因異常,16.7%(7/42)同時存在LKB1基因突變和LKB1基因缺失或單倍體改變。在LKB1突變病例中,其中2例同時伴有KRAS突變。73.3%(22/30)的BRG1陰性肺實體型腺癌存在BRG1基因突變,共26個突變位點,其中12例為錯義突變、2例為移碼突變、12例為同義突變,48.3%(14/29)存在BRG1基因缺失或單倍體改變,93.3%(28/30)至少存在一項BRG1基因異常,26.7%(8/30)同時存在BRG1基因突變和BRG1基因缺失或單倍體改變。22例LKB1和BRG1“雙陰性”病例中,68.2%(15/22)至少存在1項LKB1或BRG1基因異常,27.3%(6/22)同時存在LKBl和BRG1基因異常。8.LKB1和BRG1陰性肺實體型腺癌的甲基化檢測結(jié)果36例LKB1陰性的肺實體型腺癌中均未檢測到LKB1啟動子甲基化。26例BRG1陰性的肺實體型腺癌中均未檢測到BRG1啟動子甲基化。結(jié)論(1)肺實體型腺癌多見于男性吸煙患者,具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能,常伴較高頻率KRAS突變。(2)TTF-1、NapsinA、CK7、p40、DSC3、CgA、CD56 抗體組合有助于肺實體型腺癌的病理診斷和鑒別診斷,其中TTF-1、NapsinA、CK7至少一項陽性且p40、DSC3、 CgA、CD56均為陰性是確診肺實體型腺癌的必要條件。(3)肺實體型腺癌包括實體為主型腺癌伴粘液產(chǎn)生、伴有黏液的完全性實體型腺癌和寡粘液的完全性實體型腺癌一系列形態(tài)學譜系,三種組織學亞型在臨床病理特征、免疫表型、分子學改變及預后方面無明顯差別。(4)LKB1和BRG1表達缺失可能參與了肺實體型腺癌的發(fā)生,并在肺實體型腺癌的惡性增殖與侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。(5)LKB1與BRG1表達缺失呈正相關(guān),提示二者表達缺失可能在肺實體型腺癌的發(fā)生與惡性演進中具有協(xié)同作用。(6)LKB1和BRG1表達缺失與肺實體型腺癌TTF1、NapsinA.CK7免疫表型相關(guān),LKB1和BRG1在TTF-1/NapsinA/CK7陰性病例組的表達缺失率明顯高于陽性組,提示LKB1和BRG1表達缺失可能是TTF-1/NapsinA/CK7陰性肺實體型腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要機制。(7)LKB1表達缺失常與KRAS突變共存,BRG1缺失常與EGFR突變相排斥。(8)腫瘤體積大、伴有脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、高臨床分期、TTF-1陰性、NapsinA陰性、LKB1表達缺失、BRG1表達缺失及Ki67增殖指數(shù)高的患者預后較差。COX多因素分析顯示遠處轉(zhuǎn)移、TTF-1陰性、Napsin A陰性、LKB1表達缺失及BRG1表達缺失為影響肺實體型腺癌患者預后的獨立危險因素。(9)LKB1在肺實體型腺癌中的失活至少部分是由LKB1基因突變以及LKB1基因缺失或單倍體改變所致；BRG1基因突變以及BRGl基因缺失或單倍體改變是肺實體型腺癌中BRG1表達缺失的主要機制。(10)肺實體型腺癌中LKB1或BRG1表達缺失不是由LKB1和BRG1啟動子甲基化導致。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻】

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本文編號：2322325