發(fā)布時間：2018-11-07 08:32

【摘要】：肝癌作為惡性腫瘤疾病在臨床上發(fā)病率最高。這是因為肝細(xì)胞癌惡性程度較高,發(fā)病后,病情進(jìn)展快速,患者生存時間相對較短,針對肝細(xì)胞癌的治療手段亦發(fā)展迅速,但是受到治療手段的限制,仍有不少患者在發(fā)病5年內(nèi)死亡。最近發(fā)展的分子靶向治療因其高效性和高特異性逐漸吸引人們的注意。一種非編碼RNA是轉(zhuǎn)錄本超過200個核苷酸長度的長鏈非編碼RNA(lncRNA),非編碼RNA以基因位置決定可以分為5種不同類型,這五類包括雙向lncRNA、基因間lncRNA、基因內(nèi)lncRNA、反義lncRNA、正義lncRNA。通過基因組測序分析,我們發(fā)現(xiàn)在人類的基因組中存在大量的長鏈非編碼RNA,而其中有將近24000個左右從參與了多種基因相關(guān)功能,主要包括轉(zhuǎn)錄激活、核內(nèi)運輸、X染色體沉默、轉(zhuǎn)錄干擾、染色質(zhì)修飾等多項生物學(xué)活動。通過對長鏈非編碼RNA的研究深入開展,在多種疾病中長鏈非編碼RNA的作用越來越明顯,早期階段microRNA的研究曾經(jīng)成為熱點,而長鏈非編碼RNA在此之后再次走向研究的前沿。大量的研究指出在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中長鏈非編碼RNA的異常表達(dá)扮演了重要的角色。這是因為在早期的胚胎發(fā)育過程中長鏈非編碼RNA參與了調(diào)節(jié)過程,因此對于腫瘤的細(xì)胞增殖特點和多發(fā)性潛能具有明顯的激活作用。本文的主要重點研究涉及了長鏈非編碼RNA在腫瘤組織中的功能和作用,有助于尋找控制腫瘤生長的長鏈非編碼RNA。肝癌細(xì)胞長鏈非編碼RNA相對于正常肝細(xì)胞,其表達(dá)譜變化顯著,其中主要的變化趨勢為上調(diào)和下調(diào),而下調(diào)趨勢更為常見。這些出現(xiàn)異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA可能涉及了多個生物學(xué)過程,其中主要包括蛋白翻譯、細(xì)胞周期、mRNA剪接、基因轉(zhuǎn)錄等多種,表明長鏈非編碼RNA可在蛋白質(zhì)表達(dá)和表達(dá)后修飾等過程中發(fā)揮作用;同時長鏈非編碼RNA參與了多個重要過程的信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié),其中主要包括JAK-STAT、Notch、p53、MAPK等通路。我們首先通過Real-timePCR的方法分析臨床樣本和細(xì)胞樣本,我們證實,與健康組織和正常細(xì)胞相比,LincRNA-p21在腫瘤組織中發(fā)生表達(dá)水平大幅度下調(diào),結(jié)果暗示LincRNA-p21可能具有抑制肝癌組織生長的作用。我們通過分析肝癌腫瘤組織乙�；M蛋白與lincrna-p21啟動子的結(jié)合情況,發(fā)現(xiàn)肝癌組織和肝癌細(xì)胞乙酰化組蛋白h3水平對比正常肝臟組織和正常細(xì)胞,表達(dá)表達(dá)存在差異性。解釋了為什么正常肝臟組織中l(wèi)incrna-p21的表達(dá)水平高于肝癌組織。為了驗證lincrna-p21的生物學(xué)功能,我們通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法改變smmc-7721肝癌細(xì)胞內(nèi)lincrna-p21的表達(dá)水平。我們構(gòu)建了過表達(dá)lincrna-p21的smmc-7721細(xì)胞株,并在rna水平證明了腫瘤細(xì)胞smmc-7721轉(zhuǎn)染后發(fā)生了明顯的lincrna-p21表達(dá)水平增高,同時分析了notch信號蛋白hes-1和nicd的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,表達(dá)顯著下降,存在統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。為了進(jìn)一步驗證notch信號通路與emt相關(guān)蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)系,我們通過westernblot檢測emt相關(guān)蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表達(dá)水平,于正常組織相比,表達(dá)水平明顯下降。接下來我們通過sirna的方法構(gòu)建lincrna-p21抑制細(xì)胞株,我們發(fā)現(xiàn)hepg2細(xì)胞在發(fā)生lincrna-p21抑制后notch信號通路相關(guān)蛋白hes-1和nicd的表達(dá)水平進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)westernblot檢測notch信號蛋白hes-1和nicd的表達(dá)對比正常肝臟組織,表達(dá)顯著提高。而在蛋白水平對emt相關(guān)蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表達(dá)水平進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)westernblot檢測emt相關(guān)蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表達(dá)對比正常肝臟組織,表達(dá)顯著提高。通過dapt作用于notch信號通路可以有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移過程,我們發(fā)現(xiàn)抑制發(fā)生后notch信號蛋白hes-1和nicd的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,表達(dá)顯著下降,emt相關(guān)蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降。表明抑制notch信號通路將提高emt出現(xiàn)頻率,可能會增強肝癌的侵襲性。而激活notch信號將取消lincrna-p21過表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。再使用jagged1處理所有實驗細(xì)胞,之后采用transwell檢測細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,實驗結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的侵襲力明顯提高。為了進(jìn)一步明確lincrna-p21,notch通路以及emt之間的關(guān)系,我們通過抑制notch信號來觀察對lincrna-p21干擾對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用的影響,結(jié)果表明抑制notch信號將取消干擾lincrna-p21對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。然而,我們再使用dapt處理細(xì)胞后,經(jīng)過transwell檢測細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,我們發(fā)現(xiàn)抑制取消后,腫瘤細(xì)胞的侵略力明顯降低。通過裸鼠肝癌模型來分析LincRNA-p21可能的機制,我們發(fā)現(xiàn)裸鼠感染了轉(zhuǎn)染pcDNA-LincRNA-p21質(zhì)粒的細(xì)胞后,體內(nèi)腫瘤組織的轉(zhuǎn)移情況明顯降低,證明LincRNA-p21的過表達(dá)對肝臟腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用,隨后證明了抑制LincRNA-p21的表達(dá)水平將有效促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜上所述,我們的研究加深了對肝癌轉(zhuǎn)移機制的進(jìn)一步理解,證明LincRNA-p21對腫瘤微環(huán)境的調(diào)控起到重要作用,是其一種新的功能。研究提示肝癌的轉(zhuǎn)移過程應(yīng)該重新認(rèn)識,即在轉(zhuǎn)移的不同階段肝癌細(xì)胞利用不同的策略實現(xiàn)其惡性播散。EMT在肝癌細(xì)胞的早期侵襲過程中起著重要作用,Notch信號通路在肝癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端定植過程中起著重要作用。證明在肝癌的侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的早期及晚期階段LincRNA-p21都有抑制作用,因此LincRNA-p21有潛力作為一種肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶向治療手段及判斷患者預(yù)后的基因標(biāo)志,同時此研究結(jié)果對于肝癌的治療的預(yù)防轉(zhuǎn)移具有較高的臨床價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2315790