【摘要】：目的:利用慢病毒介導(dǎo)LIMK1沉默的方法,觀察羅格列酮(Rosiglitazone,ROS)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。方法:設(shè)計(jì)并構(gòu)建3條LIMK1沉默的sh RNA載體,包裝成慢病毒,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效率計(jì)算MOI值;采用熒光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白免疫印記法(western blot)分別在m RNA和蛋白水平上檢測(cè)LIMK1的沉默情況,選擇一條沉默效率最佳的sh RNA-LIMK1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);ROS分別處理人胃癌MGC803細(xì)胞及LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞后,在m RNA和蛋白水平上檢測(cè)LIMK1的表達(dá)情況。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察沉默LIMK1對(duì)ROS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了3條LIMK1-sh RNA慢病毒載體并包裝成病毒。設(shè)計(jì)3條LIMK1 sh RNA序列,分別為L(zhǎng)V-LIMK1-RNAi(37154-1)、LV-LIMK1-RNAi(37155-1)、LV-LIMK1-RNAi(37156-1)和一條陰性對(duì)照序列LV,并包裝成慢病毒,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到MGC803細(xì)胞的MOI值為50。2.成功篩選出最佳LIMK1-RNAi(37156-1)干擾序列。3條sh RNA干擾序列LV-LIMK1-RNAi(37156-1)、(37155-1)、(37154-1)對(duì)LIMK1 m RNA的抑制率分別為91.9%、75.9%、90.7%,蛋白抑制的效果分別為72.4%、29.4%、63.7%。其中陰性病毒組與未感染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。因此,LV-LIMK1-RNAi(37156-1)沉默效果最佳。3.ROS在m RNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表達(dá)。結(jié)果顯示:在MGC803細(xì)胞中,ROS能夠在m RNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表達(dá)(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,ROS能夠進(jìn)一步抑制LIMK1的表達(dá)(P0.05)。4.LIMK1沉默促進(jìn)了ROS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。4.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在MGC803細(xì)胞中,ROS處理組細(xì)胞活力明顯低于未處理組(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,LIMK1的沉默能夠降低細(xì)胞的增殖能力(P0.05);加入ROS處理后,LIMK1的沉默組細(xì)胞活力與未沉默組相比細(xì)胞活性有顯著減少(P0.05)。4.2平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:在MGC803細(xì)胞中,ROS處理組集落形成數(shù)明顯少于未處理組(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,沉默組集落形成數(shù)較未沉默組明顯減少(P0.05);加入ROS處理后,LIMK1的沉默組與未沉默組比較細(xì)胞集落數(shù)有顯著性減少(P0.05)。4.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期結(jié)果顯示:在MGC803細(xì)胞中,ROS處理組細(xì)胞周期發(fā)生G1期停滯的現(xiàn)象,而相應(yīng)的S期細(xì)胞數(shù)量則顯著減少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,LIMK1沉默組的G1期細(xì)胞比例也明顯增加(P0.05);加入ROS處理后,LIMK1的沉默組與未沉默組比較G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加。4.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示:在MGC803細(xì)胞中,ROS處理組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,LIMK1沉默組遷移細(xì)胞數(shù)也明顯減少(P0.05);加入ROS處理后,LIMK1的沉默組與未沉默組比較遷移細(xì)胞數(shù)有顯著性減少(P0.05)。4.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示:在MGC803細(xì)胞中,ROS處理組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中,LIMK1沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)也明顯減少(P0.05);加入ROS處理后,LIMK1的沉默組與未沉默組比較穿膜細(xì)胞數(shù)有顯著性減少(P0.05)。結(jié)論:1.ROS可抑制人胃癌MGC803細(xì)胞中LIMK1表達(dá),且LIMK1沉默后ROS對(duì)LIMK1抑制更顯著。2.沉默LIMK1可促進(jìn)羅格列酮抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2313933