【摘要】：目的:肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害健康。近年來,在傳統(tǒng)的放療、化療、手術(shù)治療之外,又出現(xiàn)了以RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)為治療手段的基因治療。RNAi需要載體將作為藥物的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞,該過程稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染需要載體才能進(jìn)行。以病毒為載體遞送si RNA轉(zhuǎn)染效率高,但存在免疫原性、致癌性等弊端;非病毒載體具有低毒性、低免疫原性、低致癌性、易制備、便于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn),但是轉(zhuǎn)染效率要明顯低于病毒載體,因此提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率是基因治療的關(guān)鍵和基礎(chǔ),成為目前的研究熱點(diǎn)。方法:本研究以氧化石墨烯為主體,制備了一種復(fù)合靶向si RNA載體GA-PEG-PKAE-GO,其中GO(graphene oxide,氧化石墨烯)為載體的主體結(jié)構(gòu);GA(glycyrrhetinic acid,甘草次酸)為肝靶向配體;PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)可提高復(fù)合物的血液循環(huán)時(shí)間;PKAE是一種高分子聚合物,能夠以靜電作用與si RNA結(jié)合,末端的芘基(pyrene group)可與GO通過π-π堆積結(jié)合。本研究也對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)si RNA的功能進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)價(jià)。1.2,2-二甲氧基丙烷與2-丙烯酸羥乙酯發(fā)生縮酮交換反應(yīng),得到KDA,KDA與二亞乙基三胺發(fā)生氮雜邁克爾加成反應(yīng),生成PKAE;用酸堿滴定法測(cè)定PKAE的緩沖能力;用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定PKAE在體外結(jié)合/釋放si RNA的能力。2.通過EDC/NHS反應(yīng)先后合成GA-PEG與GA-PEG-GO,PKAE與GA-PEG-GO通過π-π堆積作用非共價(jià)結(jié)合;測(cè)定GA-PEG-PKAE-GO的粒徑、ζ-電位與多分散系數(shù),考察GA-PEG-PKAE-GO的光熱效應(yīng)以及體外結(jié)合/釋放si RNA的能力。3.以人肝癌細(xì)胞系Hep G2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):采用MTT法測(cè)定GAPEG-PKAE-GO的細(xì)胞毒性;以FAM標(biāo)記的si RNA為熒光標(biāo)記,測(cè)定復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率;采用鈣黃綠素和Lyso Tracker Red雙染法考察復(fù)合物的內(nèi)吞體逃逸和si RNA的釋放;用GA-PEG-PKAE-GO遞送Bcl-2 si RNA,通過RT-PCR測(cè)定Bcl-2 m RNA的轉(zhuǎn)錄,并且通過Western Blotting法測(cè)定Bcl-2蛋白質(zhì)的翻譯,考察si RNA的基因沉默功效;采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性,并在Annexin V/PI雙染色的基礎(chǔ)上,觀察該復(fù)合載體的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能。4.裸鼠體內(nèi)植入人肝癌細(xì)胞Hep G2,以多柔比星為熒光標(biāo)記,給予裸鼠GA-PEGPKAE-GO/多柔比星復(fù)合物,通過熒光分光光度法測(cè)定多柔比星在不同器官中的分布,考察復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO在不同器官組織中的分布狀況。結(jié)果:1.合成了高分子聚合物PKAE;它在p H7.4條件下可以結(jié)合si RNA,在p H 5.4的酸性環(huán)境下能水解成小分子,釋放si RNA。2.合成了復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO,其粒徑為(266.1±101.8)nm,PDI為0.380,ζ-電位為(46.9±7.96)m V;在波長(zhǎng)為808 nm、功率為0.25W的近紅外線照射下,5分鐘使液體溫度上升3.8℃,顯著高于對(duì)照組;它在p H7.4條件下可以結(jié)合si RNA,在p H 5.4的酸性環(huán)境下,與si RNA結(jié)合的PKAE模塊能水解成小分子,釋放si RNA。3.MTT實(shí)驗(yàn)表明,給予復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力與對(duì)照組沒有顯著的差異。轉(zhuǎn)染效率試驗(yàn)顯示,GA-PEG-PKAE-GO可以將FAM-si RNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞,GA-PEG-PKAE-GO組的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射熒光的細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(Lipofectamine 2000),808 nm近紅外激光照射的GA-PEG-PKAE-GO組的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射熒光的細(xì)胞數(shù)量高于GA-PEG-PKAE-GO組。內(nèi)吞體逃逸試驗(yàn)顯示,GA-PEGPKAE-GO所攜帶的si RNA發(fā)射的綠熒光與Lyso-Tracker Red所標(biāo)記的內(nèi)吞體/溶酶體發(fā)射的紅色熒光基本重合;隨著時(shí)間的延長(zhǎng),紅色熒光逐漸減弱,綠色熒光在胞內(nèi)擴(kuò)散,表明GA-PEG-PKAE-GO在內(nèi)吞體中酸性環(huán)境下打破了內(nèi)吞體并將si RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blotting實(shí)驗(yàn)分別顯示,在轉(zhuǎn)染Bcl-2 si RNA之后,m RNA的轉(zhuǎn)錄水平和Bcl-2蛋白質(zhì)翻譯水平明顯降低。MTT實(shí)驗(yàn)顯示,在轉(zhuǎn)染Bcl-2 si RNA之后,Hep G2細(xì)胞的活力顯著下降。流式細(xì)胞分析顯示,在轉(zhuǎn)染Bcl-2si RNA之后,Hep G2細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡。4.組織分布實(shí)驗(yàn)顯示,復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO在裸鼠肝臟和腫瘤組織中的分布顯著超過其他器官。結(jié)論:復(fù)合靶向載體GA-PEG-PKAE-GO能夠在體內(nèi)靶向運(yùn)輸si RNA,順利地轉(zhuǎn)染si RNA,在胞內(nèi)釋放si RNA,并且保證si RNA在胞內(nèi)發(fā)揮作用,具有較好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2310672