【摘要】：第一部分目的:檢測(cè)橋接整合因子-1(bridging integrator-1,Bin1)在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞和正常人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況,篩選出Bin1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞;構(gòu)建Bin1穩(wěn)定過表達(dá)的慢病毒載體質(zhì)粒,研究Bin1過表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞系H1975細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。方法:1采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantificational real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)方法和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bin1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況,篩選出Bin1低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞。2構(gòu)建攜帶Bin1基因的慢病毒載體p CDH-Bin1,體外以病毒轉(zhuǎn)染的方式將Bin1基因轉(zhuǎn)入H1975細(xì)胞(Bin1+組),并分別設(shè)置空載體組(p CDH組)和空白對(duì)照組(Con組),流式細(xì)胞術(shù)分別篩選出穩(wěn)定表達(dá)Bin1和空載體的H1975細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng)后,經(jīng)qRT-PCR和Western blot方法鑒定,獲得穩(wěn)定過表達(dá)Bin1的H1975細(xì)胞系。3利用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bin1對(duì)H1975細(xì)胞增殖能力的影響。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bin1對(duì)H1975細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bin1對(duì)H1975細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果:1 qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞相比,H1975、H1650、A549中Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平明顯低于2BS細(xì)胞中Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平,其中H1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)量最低(P0.05),而H460中Bin1基因和蛋白表達(dá)量與2BS細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。篩選出Bin1表達(dá)量最低的H1975細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組H1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),p CDH組和Con組相比,Bin1基因和蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1已成功轉(zhuǎn)入H1975細(xì)胞中。以流式細(xì)胞術(shù)篩選的方式獲得穩(wěn)定過表達(dá)Bin1的Bin1+細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)p CDH載體的p CDH組細(xì)胞。3 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在H1975細(xì)胞中,Bin1+組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0543±0.021,0.1249±0.034,0.2348±0.027,0.3594±0.019,0.4923±0.031;p CDH組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0634±0.024,0.3549±0.037,0.4988±0.047,0.9857±0.019,1.524±0.053;Con組細(xì)胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0619±0.029,0.3624±0.042,0.4874±0.039,0.9957±0.023,1.5097±0.046。與p CDH組和Con組相比,Bin1在48h、72h、96h、120h可以抑制H1975細(xì)胞的增殖活性(P0.05),而p CDH組和Con組細(xì)胞的增殖活性相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1可以抑制H1975細(xì)胞的增殖活性。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相同條件培養(yǎng)7天后,Bin1+組細(xì)胞克隆形成能力為p CDH組的59%(P0.05),為Con組的61%(P0.05),而p CDH組和Con組細(xì)胞的克隆形成能力相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明Bin1可以抑制H1975細(xì)胞的克隆形成能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Bin1可以抑制H1975細(xì)胞的增殖能力。4細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Bin1+組細(xì)胞G0/G1期比例為(67.12±1.74)%,p CDH組細(xì)胞G0/G1期比例為(55.81±1.48)%,Con組細(xì)胞G0/G1期比例為(56.41±2.03)%,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加(P0.05),而p CDH組和Con組相比G0/G1期比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1+組細(xì)胞中DNA合成受限,阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,進(jìn)而誘導(dǎo)H1975細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Bin1+組細(xì)胞12h遷移距離為(25.3±2.6)μm,p CDH組細(xì)胞12h遷移距離為(58±5.2)μm,Con組細(xì)胞12h遷移距離為(60.21±4.2)μm;Bin1+組24h遷移距離為(58.7±3.8)μm,p CDH組24h遷移距離為(92.3±4.3)μm,Con組24h遷移距離為(89.7±5.8)μm。與p CDH組和Con組相比,Bin1+組遷移變化在12h及24h后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)0.05),且細(xì)胞遷移距離明顯縮短(P(27)0.05);而p CDH組和Con組相比,劃痕12h及24h后細(xì)胞遷移變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1能夠抑制H1975細(xì)胞的遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,Bin1+組、p CDH組、Con組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為50.50±3.15、124.00±4.25、130±4.37,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低(P0.05),而p CDH組和Con組相比,兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1能夠降低H1975細(xì)胞的侵襲能力。第二部分目的:檢測(cè)程序死亡因子受體(programmed death ligand 1,PD-L1)在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況,通過過表達(dá)和RNA干擾兩種方式研究Bin1對(duì)免疫抑制因子PD-L1表達(dá)水平的影響,分析Bin1抑制NSCLC免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制。方法:1 qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD-L1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞中的表達(dá)情況,并檢測(cè)Bin1對(duì)H1975細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響。2構(gòu)建Bin1-si RNA,將其轉(zhuǎn)染入人H460細(xì)胞(Bin1-si RNA組)中,并設(shè)置空白對(duì)照組(Con組),通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾效果,同時(shí)用qRT-PCR、Western blot方法檢測(cè)敲除Bin1對(duì)PD-L1表達(dá)水平的影響。3構(gòu)建c-MYC-si RNA,qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾效果,并檢測(cè)敲除c-MYC對(duì)PD-L1表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1 qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與人胚肺成纖維細(xì)胞2BS細(xì)胞相比,H1975、H1650、A549細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白的表達(dá)水平明顯高于2BS細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白的表達(dá)水平,其中H1975細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白表達(dá)量最高(P0.05),而H460和A549細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白表達(dá)量與2BS細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)合第一部分第一個(gè)結(jié)果,篩選出Bin1表達(dá)量最低而PD-L1表達(dá)量最高的H1975細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05),而p CDH組和Con組細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明Bin1過表達(dá)可以抑制H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平。2 qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明,與Con組相比,Bin1-si RNA組H1975細(xì)胞中Bin1基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.05),說明H1975細(xì)胞中的Bin1已經(jīng)成功被敲低。與Con組相比,Bin1-si RNA組細(xì)胞中PD-L1水平明顯上調(diào)(P0.05),說明Bin1可以負(fù)向調(diào)控PD-L1的表達(dá)。3 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與Con組相比,c-MYC-si RNA組H1975細(xì)胞中c-MYC基因和蛋白水平明顯下調(diào)(P0.05),表明H1975細(xì)胞中的c-MYC已經(jīng)成功被敲低;與Con組相比,c-MYC-si RNA組H1975細(xì)胞中PD-L1基因和蛋白水平明顯下降(P0.05),說明Bin1可以通過失活c-MYC抑制PD-L1的表達(dá)進(jìn)而抑制NSCLC的免疫逃逸。結(jié)論:1在人非小細(xì)胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS中,H1975細(xì)胞中的Bin1基因和蛋白表達(dá)水平最低;以慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立Bin1穩(wěn)定過表達(dá)的H1975細(xì)胞系。2 Bin1能夠抑制H1975細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。3在人非小細(xì)胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細(xì)胞2BS中,H1975細(xì)胞中的PD-L1基因和蛋白表達(dá)水平最高;Bin1可以抑制H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平,敲低H1975細(xì)胞中c-MYC的表達(dá)水平可以顯著下調(diào)H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平,說明Bin1可以通過失活c-MYC途徑抑制非小細(xì)胞肺癌中PD-L1的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Yan-yan Chen;Liu-bo Wang;Hui-li Zhu;Xiang-yang Li;Yan-ping Zhu;Yu-lei Yin;Fan-zhen Lü;Zi-li Wang;Jie-ming Qu;;Relationship Between Programmed Death-ligand 1 and Clinicopathological Characteristics in Non-small Cell Lung Cancer Patients[J];Chinese Medical Sciences Journal;2013年03期

2 ;Identification of a novel splice variant of human PD-L1 mRNA encoding an isoform-lacking Igv-like domain[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年04期

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本文編號(hào)：2306212