【摘要】：大腸癌又稱為結直腸癌（colorectal cancer，CRC），是一種常見的消化道惡性腫瘤。在西方國家，CRC是一種常見的致死性疾病,每年有超過百萬人被診斷為CRC并且大約一半的人因此死亡。CRC是美國惡性腫瘤的第二位。在我國，CRC居惡性腫瘤的第四位。腫瘤的浸潤程度、是否發(fā)生淋巴結和遠處轉移是決定其預后的一個重要的因素，原位癌（I期）的5年生存率超過90％，而轉移到遠處器官（IV期）時，5年生存率僅為約10％。顯然需要一種更好的生物標志物，以改善對CRC的篩查和診斷效果。II期和III期的大腸癌患者手術切除后是否應接受輔助化療以及進行何種化療，都影響其預后。對于已經(jīng)發(fā)生轉移的CRC（IV期）患者來說，雖然已失去手術切除的指征，但仍然存在是否進行“傳統(tǒng)”化療與新的生物治療相組合，以延長生存期的選擇。因此，找到新的的生物標志物用于預測患者對化療藥物的反應也迫在眉睫。 蛋白質組學的概念自提出以來，己廣泛的應用于醫(yī)學的各個領域，并取得了許多開創(chuàng)性的成果。近年來，蛋白質組學技術的快速發(fā)展使其在各種惡性腫瘤的研究中也有廣泛應用，為我們進一步了解腫瘤的發(fā)病機制以及開展腫瘤的個體化治療提供了一種新的手段。 本研究旨在應用蛋白組學的方法研究大腸癌腫瘤組織與癌旁組織之間蛋白表達譜的差異，從而建立大腸癌的差異表達譜，以期篩選出可用于大腸癌輔助診斷的生物標記物。在本研究中不能對篩選出的所有差異蛋白做深入研究，因此從差異表達蛋白譜中選取MYH9作為目標蛋白，采用Western Blot的方法驗證了其表達情況，并構建慢病毒表達載體，觀察RNA干擾MYH9基因的表達對大腸癌細胞系SW480的增殖、凋亡、細胞周期以及細胞亞結構等的影響，從而進一步了解MYH9的生物學功能。本研究共分為三部分 第一部分：TNM Ⅲ期大腸癌與癌旁組織的差異蛋白譜的建立 方法： 1、選取25例TNM Ⅲ期大腸腺癌患者術中切除的腫瘤組織標本及配對的癌旁正常組織標本作為研究對象。所用癌旁組織均取自癌組織上端，且距離癌組織均大于10厘米。所有患者術前均未接受任何化療和放療，且腫瘤組織標本術后均經(jīng)病理學證實為TNM Ⅲ期腺癌。術中切除的組織經(jīng)PBS沖洗放入液氮速凍，再置于-80℃冰箱保存。 2、提取腫瘤組織和癌旁組織中的總蛋白，并分析組織的蛋白質濃度。 3、制備蛋白水解多肽混合物。 4、采用二維液相色譜法進行樣本的分離。 5、通過LTQXL離子肼質譜儀對二維色譜洗脫的多肽進行檢測。 6、對質譜數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，找到癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白質。 結果： 1、經(jīng)二維色譜與質譜聯(lián)用的分析，在大腸癌組織標本中共獲得了579個蛋白點；癌旁組織中共獲得了492個蛋白質點。將這些蛋白點進行比對，并經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白質共有35個。 2、在腫瘤組織中上調表達的25個蛋白質分別是： FBLN1、 MYH9、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、 CKAP4、 IGHA2、 POSTN、 FGB、 FGG、 PKM2、 HIST1H2AE、MYH10和TUBB。 3、在腫瘤組織中下調表達的10個蛋白質分別是： SYNM、 MYH11、PKM2、 KRT10、 FLNC、 H2AFX、 CAP1、 MYL6、 TUBB2A、 TLN1、TGFB1I1、VCL、SYNM、ACTC1和CNN1。 4、通過本次研究我們建立了大腸癌組織和癌旁組織的差異表達蛋白譜，為進一步深入研究大腸癌的發(fā)病機制等提供實驗數(shù)據(jù)。 5、從差異表達蛋白譜中選取MYH9作為目標蛋白進行后續(xù)研究。 第二部分驗證MYH9在大腸癌中的表達 方法： 選取30例原發(fā)性大腸癌組織標本和30例配對癌旁組織標本，用Western Blot的方法鑒定目標蛋白MYH9在大腸癌組織及癌旁組織中的表達情況。 結果： 經(jīng)Western Blot證實大腸癌組織中MYH9的表達量顯著高于癌旁組織(P0.05)，這也在一定程度上驗證了第一部分蛋白質組學結果的可靠性。 第三部分：RNA干擾對大腸癌生物學行為的影響 方法： 1、培養(yǎng)SW480細胞株，對其進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察MYH9在SW480細胞內的定位及表達情況。 2、從GenBank中提取MYH9基因序列，構建針對MYH9靶序列的GV248慢病毒載體MYH9siRNA。 3、使用大提質粒試劑盒提取質粒，用分光光度計測定提取質粒的OD260數(shù)值，計算質粒DNA的濃度；分別在260nm和280nm測定溶液的吸光度值，計算OD260/280比值確定質粒DNA的純度。 4、用GenEscortTMⅡ基因轉染試劑盒進行轉染。我們構建的GV248慢病毒載體內攜帶表達EGFP的基因，熒光顯微鏡下觀察轉染陽性的細胞會呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，通過轉染細胞中綠色熒光蛋白的表達量來確定細胞的轉染效率。 5、Real-Time PCR法檢測MYH9siRNA對SW480細胞MYH9mRNA表達量的影響。 6、對SW480細胞株進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察Control質粒轉染的SW480細胞、psiMYH9質粒轉染的SW480細胞內MYH9蛋白的表達情況。MYH9蛋白在SW480細胞中表達呈紅色熒光，根據(jù)紅色熒光的熒光強度變化，確定細胞MYH9蛋白的表達量，并對二者的差異進行統(tǒng)計學分析。 7、采用cck8法進行細胞增殖實驗，觀察psiMYH9轉染對SW480細胞增殖的影響。 8、采用流式細胞術檢測psiMYH9轉染后細胞周期的改變，與Control質粒轉染的SW480細胞的細胞周期進行比較，對各期細胞數(shù)的差異進行統(tǒng)計學分析。采用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒檢測psiMYH9轉染后SW480細胞的凋亡指數(shù)，并與Control質粒轉染的SW480細胞的凋亡指數(shù)進行比較，對其差異進行統(tǒng)計學分析。用熒光顯微鏡觀察：凋亡細胞和壞死細胞都會被Annexin V-PE染成紅色，而正常細胞不會被Annexin V-PE染色。我們構建的慢病毒表達載體可表達綠色熒光蛋白，因此成功轉染后的細胞會呈現(xiàn)綠色熒光。 9、電鏡下觀察psiMYH9轉染組、對照質粒轉染組SW480細胞的亞結構。 結果： 1、熒光顯微鏡下可見MYH9蛋白陰性表達的SW480細胞內由Hoechest33342染色的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，細胞漿不著色。MYH9蛋白陽性表達的細胞細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，細胞漿呈現(xiàn)紅色熒光。MYH9蛋白定位于SW480細胞的細胞漿，為高等強度表達。 2、成功獲得能夠高效轉染SW480細胞的慢病毒重組表達載體。針對靶序列MYH9-RNAi(26358)的慢病毒載體命名為psiMHY9-1；針對MYH9-RNAi(26359)靶序列命名為psiMHY9-2；針對MYH9-RNAi(26360)靶序列命名為psiMHY9-3；針對MYH9-RNAi(26361)命名為psiMHY9-4。 3、RNA干擾對MYH9基因轉錄水平的影響：轉染psiMYH9-2質粒組MYH9基因轉錄水平顯著下降，與control質粒轉染組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。轉染psiMYH9-1、 psiMYH9-3、psiMYH9-4質粒組MYH9基因轉錄水平與轉染Control質粒組相比差異沒有統(tǒng)計學意義（P0.01）。在構建的4個慢病毒載體中以psiMYH9-2對MYH9基因表達的抑制作用最強。因此，在接下來對MYH9的功能的研究中我們應用psiMYH9-2進行實驗。 4、RNA干擾對MYH9蛋白表達的影響：psiMYH9-2質粒轉染組MYH9蛋白表達明顯低于轉染control質粒組，將二者進行比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.05）。 5、RNA干擾對細胞增殖的影響：在RNAi質粒轉染24h時，psiMYH9-2質粒轉染組細胞存活率與轉染control質粒組和正常培養(yǎng)的SW480細胞相比明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01，P0.01)。 在RNAi質粒轉染48h時，psiMYH9-2質粒轉染組細胞存活率與轉染control質粒組和正常培養(yǎng)的SW480細胞相比也明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01，P0.01)。 48h與24h時細胞的存活率沒有明顯差別(P㧐0.05)。 6、RNA干擾對細胞周期的影響： psiMYH9-2轉染組的G1期細胞的比例增加,與control組相比差異有統(tǒng)計學意義（P 0.001）；S期細胞的比例無明顯差別，與control組相比差異無統(tǒng)計學意義（P㧐0.05）；G2期的比例減少，與control組相比差異有統(tǒng)計學意義（P 0.01）。 7、RNA干擾對細胞凋亡的影響： 轉染control質粒的SW480細胞組偶見凋亡細胞，轉染psiMYH9-2的細胞，紅色熒光細胞明顯增多，具有早期凋亡特征的細胞偶見，凋亡晚期和壞死的細胞多見。 pControl質粒轉染組和psiMYH9-2質粒轉染組SW480細胞凋亡指數(shù)分別為6.53±1.67%和18.48±3.66%，psiMYH9-2轉染組明顯高于轉染control質粒組，經(jīng)統(tǒng)計學分析，二者的差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.01）。 8、RNA干擾對細胞亞結構的影響： 轉染pControl質粒的SW480細胞，細胞核多為圓形和不規(guī)則圓形，染色質均勻分布，核仁清晰，，核質比大，細胞膜邊緣清晰，細胞器結構完整。 psiMYH9-2質粒轉染后SW480細胞的細胞核內異染色質增多和邊集，核固縮，常染色質減少，細胞核空化。細胞漿可見內質網(wǎng)腔擴張，出現(xiàn)次級溶酶體，內含殘缺線粒體，胞漿可見質地不均、高電子密度及空泡狀物質。與轉染pControl質粒的SW480細胞相比，亞結構發(fā)生了明顯變化。 通過以上研究，我們得出以下結論： 1.本研究成功建立了TNM Ⅲ期大腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜。 2.驗證了大腸癌組織中MYH9的表達量顯著高于癌旁組織。 3.成功構建了沉默MYH9基因的GV248慢病毒表達載體，并成功轉染大腸癌SW480細胞。 4. RNA干擾MYH9基因的表達后大腸癌的生物學行為發(fā)生了明顯的改變：SW480細胞中MYH9mRNA以及MYH9蛋白的表達量明顯減低、SW480細胞的增殖受到明顯抑制、凋亡顯著增強、細胞周期和亞結構也發(fā)生了明顯改變。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：2298216