【摘要】：大腸癌又稱(chēng)為結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC），是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。在西方國(guó)家，CRC是一種常見(jiàn)的致死性疾病,每年有超過(guò)百萬(wàn)人被診斷為CRC并且大約一半的人因此死亡。CRC是美國(guó)惡性腫瘤的第二位。在我國(guó)，CRC居惡性腫瘤的第四位。腫瘤的浸潤(rùn)程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是決定其預(yù)后的一個(gè)重要的因素，原位癌（I期）的5年生存率超過(guò)90％，而轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官（IV期）時(shí)，5年生存率僅為約10％。顯然需要一種更好的生物標(biāo)志物，以改善對(duì)CRC的篩查和診斷效果。II期和III期的大腸癌患者手術(shù)切除后是否應(yīng)接受輔助化療以及進(jìn)行何種化療，都影響其預(yù)后。對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRC（IV期）患者來(lái)說(shuō)，雖然已失去手術(shù)切除的指征，但仍然存在是否進(jìn)行“傳統(tǒng)”化療與新的生物治療相組合，以延長(zhǎng)生存期的選擇。因此，找到新的的生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)也迫在眉睫。 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念自提出以來(lái)，己廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，并取得了許多開(kāi)創(chuàng)性的成果。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使其在各種惡性腫瘤的研究中也有廣泛應(yīng)用，為我們進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)展腫瘤的個(gè)體化治療提供了一種新的手段。 本研究旨在應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法研究大腸癌腫瘤組織與癌旁組織之間蛋白表達(dá)譜的差異，從而建立大腸癌的差異表達(dá)譜，以期篩選出可用于大腸癌輔助診斷的生物標(biāo)記物。在本研究中不能對(duì)篩選出的所有差異蛋白做深入研究，因此從差異表達(dá)蛋白譜中選取MYH9作為目標(biāo)蛋白，采用Western Blot的方法驗(yàn)證了其表達(dá)情況，并構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，觀察RNA干擾MYH9基因的表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞系SW480的增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)等的影響，從而進(jìn)一步了解MYH9的生物學(xué)功能。本研究共分為三部分 第一部分：TNM Ⅲ期大腸癌與癌旁組織的差異蛋白譜的建立 方法： 1、選取25例TNM Ⅲ期大腸腺癌患者術(shù)中切除的腫瘤組織標(biāo)本及配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本作為研究對(duì)象。所用癌旁組織均取自癌組織上端，且距離癌組織均大于10厘米。所有患者術(shù)前均未接受任何化療和放療，且腫瘤組織標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為T(mén)NM Ⅲ期腺癌。術(shù)中切除的組織經(jīng)PBS沖洗放入液氮速凍，再置于-80℃冰箱保存。 2、提取腫瘤組織和癌旁組織中的總蛋白，并分析組織的蛋白質(zhì)濃度。 3、制備蛋白水解多肽混合物。 4、采用二維液相色譜法進(jìn)行樣本的分離。 5、通過(guò)LTQXL離子肼質(zhì)譜儀對(duì)二維色譜洗脫的多肽進(jìn)行檢測(cè)。 6、對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，找到癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1、經(jīng)二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的分析，在大腸癌組織標(biāo)本中共獲得了579個(gè)蛋白點(diǎn)；癌旁組織中共獲得了492個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。將這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，并經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共有35個(gè)。 2、在腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)的25個(gè)蛋白質(zhì)分別是： FBLN1、 MYH9、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、 CKAP4、 IGHA2、 POSTN、 FGB、 FGG、 PKM2、 HIST1H2AE、MYH10和TUBB。 3、在腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)的10個(gè)蛋白質(zhì)分別是： SYNM、 MYH11、PKM2、 KRT10、 FLNC、 H2AFX、 CAP1、 MYL6、 TUBB2A、 TLN1、TGFB1I1、VCL、SYNM、ACTC1和CNN1。 4、通過(guò)本次研究我們建立了大腸癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)蛋白譜，為進(jìn)一步深入研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制等提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 5、從差異表達(dá)蛋白譜中選取MYH9作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。 第二部分驗(yàn)證MYH9在大腸癌中的表達(dá) 方法： 選取30例原發(fā)性大腸癌組織標(biāo)本和30例配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，用Western Blot的方法鑒定目標(biāo)蛋白MYH9在大腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 經(jīng)Western Blot證實(shí)大腸癌組織中MYH9的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P0.05)，這也在一定程度上驗(yàn)證了第一部分蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。 第三部分：RNA干擾對(duì)大腸癌生物學(xué)行為的影響 方法： 1、培養(yǎng)SW480細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察MYH9在SW480細(xì)胞內(nèi)的定位及表達(dá)情況。 2、從GenBank中提取MYH9基因序列，構(gòu)建針對(duì)MYH9靶序列的GV248慢病毒載體MYH9siRNA。 3、使用大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)定提取質(zhì)粒的OD260數(shù)值，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度；分別在260nm和280nm測(cè)定溶液的吸光度值，計(jì)算OD260/280比值確定質(zhì)粒DNA的純度。 4、用GenEscortTMⅡ基因轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。我們構(gòu)建的GV248慢病毒載體內(nèi)攜帶表達(dá)EGFP的基因，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)量來(lái)確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。 5、Real-Time PCR法檢測(cè)MYH9siRNA對(duì)SW480細(xì)胞MYH9mRNA表達(dá)量的影響。 6、對(duì)SW480細(xì)胞株進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞、psiMYH9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞內(nèi)MYH9蛋白的表達(dá)情況。MYH9蛋白在SW480細(xì)胞中表達(dá)呈紅色熒光，根據(jù)紅色熒光的熒光強(qiáng)度變化，確定細(xì)胞MYH9蛋白的表達(dá)量，并對(duì)二者的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 7、采用cck8法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察psiMYH9轉(zhuǎn)染對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響。 8、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)psiMYH9轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的改變，與Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行比較，對(duì)各期細(xì)胞數(shù)的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)psiMYH9轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的凋亡指數(shù)，并與Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的凋亡指數(shù)進(jìn)行比較，對(duì)其差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用熒光顯微鏡觀察：凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞都會(huì)被Annexin V-PE染成紅色，而正常細(xì)胞不會(huì)被Annexin V-PE染色。我們構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體可表達(dá)綠色熒光蛋白，因此成功轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)綠色熒光。 9、電鏡下觀察psiMYH9轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1、熒光顯微鏡下可見(jiàn)MYH9蛋白陰性表達(dá)的SW480細(xì)胞內(nèi)由Hoechest33342染色的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞漿不著色。MYH9蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞漿呈現(xiàn)紅色熒光。MYH9蛋白定位于SW480細(xì)胞的細(xì)胞漿，為高等強(qiáng)度表達(dá)。 2、成功獲得能夠高效轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的慢病毒重組表達(dá)載體。針對(duì)靶序列MYH9-RNAi(26358)的慢病毒載體命名為psiMHY9-1；針對(duì)MYH9-RNAi(26359)靶序列命名為psiMHY9-2；針對(duì)MYH9-RNAi(26360)靶序列命名為psiMHY9-3；針對(duì)MYH9-RNAi(26361)命名為psiMHY9-4。 3、RNA干擾對(duì)MYH9基因轉(zhuǎn)錄水平的影響：轉(zhuǎn)染psiMYH9-2質(zhì)粒組MYH9基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，與control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。轉(zhuǎn)染psiMYH9-1、 psiMYH9-3、psiMYH9-4質(zhì)粒組MYH9基因轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)染Control質(zhì)粒組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。在構(gòu)建的4個(gè)慢病毒載體中以psiMYH9-2對(duì)MYH9基因表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。因此，在接下來(lái)對(duì)MYH9的功能的研究中我們應(yīng)用psiMYH9-2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 4、RNA干擾對(duì)MYH9蛋白表達(dá)的影響：psiMYH9-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組MYH9蛋白表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒組，將二者進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 5、RNA干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響：在RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h時(shí)，psiMYH9-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率與轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒組和正常培養(yǎng)的SW480細(xì)胞相比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01，P0.01)。 在RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h時(shí)，psiMYH9-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率與轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒組和正常培養(yǎng)的SW480細(xì)胞相比也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01，P0.01)。 48h與24h時(shí)細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯差別(P㧐0.05)。 6、RNA干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響： psiMYH9-2轉(zhuǎn)染組的G1期細(xì)胞的比例增加,與control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.001）；S期細(xì)胞的比例無(wú)明顯差別，與control組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㧐0.05）；G2期的比例減少，與control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.01）。 7、RNA干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響： 轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒的SW480細(xì)胞組偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，轉(zhuǎn)染psiMYH9-2的細(xì)胞，紅色熒光細(xì)胞明顯增多，具有早期凋亡特征的細(xì)胞偶見(jiàn)，凋亡晚期和壞死的細(xì)胞多見(jiàn)。 pControl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和psiMYH9-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為6.53±1.67%和18.48±3.66%，psiMYH9-2轉(zhuǎn)染組明顯高于轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.01）。 8、RNA干擾對(duì)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的影響： 轉(zhuǎn)染pControl質(zhì)粒的SW480細(xì)胞，細(xì)胞核多為圓形和不規(guī)則圓形，染色質(zhì)均勻分布，核仁清晰，，核質(zhì)比大，細(xì)胞膜邊緣清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整。 psiMYH9-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多和邊集，核固縮，常染色質(zhì)減少，細(xì)胞核空化。細(xì)胞漿可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張，出現(xiàn)次級(jí)溶酶體，內(nèi)含殘缺線(xiàn)粒體，胞漿可見(jiàn)質(zhì)地不均、高電子密度及空泡狀物質(zhì)。與轉(zhuǎn)染pControl質(zhì)粒的SW480細(xì)胞相比，亞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。 通過(guò)以上研究，我們得出以下結(jié)論： 1.本研究成功建立了TNM Ⅲ期大腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜。 2.驗(yàn)證了大腸癌組織中MYH9的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。 3.成功構(gòu)建了沉默MYH9基因的GV248慢病毒表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染大腸癌SW480細(xì)胞。 4. RNA干擾MYH9基因的表達(dá)后大腸癌的生物學(xué)行為發(fā)生了明顯的改變：SW480細(xì)胞中MYH9mRNA以及MYH9蛋白的表達(dá)量明顯減低、SW480細(xì)胞的增殖受到明顯抑制、凋亡顯著增強(qiáng)、細(xì)胞周期和亞結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2298216