【摘要】：研究背景與目的腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的重要原因,同時(shí)也是一個(gè)非常復(fù)雜的生化反應(yīng)過程。這個(gè)過程是通過多個(gè)連續(xù)的步驟實(shí)現(xiàn)的,包括腫瘤細(xì)胞原位增殖、突破基質(zhì)和血管壁、進(jìn)入血液循環(huán)、粘附并穿出血管、定殖到靶器官等,其中腫瘤細(xì)胞粘附并穿出血管是整個(gè)轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵步驟,決定了轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞最終到達(dá)的目的地。大量的臨床觀察以及研究已經(jīng)證明,腫瘤具有向某些特定器官轉(zhuǎn)移的傾向,如結(jié)腸癌易轉(zhuǎn)移至肝臟,乳腺癌易轉(zhuǎn)移至肺和肝臟,前列腺癌易轉(zhuǎn)移至骨,這種行為被稱為腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移。人們很早就認(rèn)識到腫瘤這種特殊的的行為,并試圖探究其背后的機(jī)制。1889年,斯蒂芬·派杰特(Stephen Paget)提出“種子和土壤”假說,認(rèn)為腫瘤的轉(zhuǎn)移取決于腫瘤細(xì)胞(種子)和靶器官的微環(huán)境(土壤)之間的相互作用。此假說一經(jīng)提出,即成為解釋腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移的重要理論依據(jù)。在此之后的許多研究都支持種子和土壤假說的真實(shí)性,并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了更多新的理論。2005年,羅塞德·卡普蘭(Rosandra Kaplan)在自然雜志上發(fā)表論文,在種子與土壤理論的基礎(chǔ)上提出“腫瘤轉(zhuǎn)移前期”(pre-metastatic nich)的概念。他認(rèn)為,腫瘤轉(zhuǎn)移之前,一群VEGFR1陽性的骨髓細(xì)胞會先一步聚集在靶器官,以旁分泌細(xì)胞因子或者通過整合素與基質(zhì)相互作用的方式改變靶器官的微環(huán)境,從而為腫瘤細(xì)胞的到來準(zhǔn)備好一個(gè)舒適的溫床。卡普蘭的腫瘤前轉(zhuǎn)移理論為解釋腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移打開了一扇新的大門,使人們的目光更多地集中到腫瘤轉(zhuǎn)移前靶器官微環(huán)境的變化上來。乳腺癌是最常見的腫瘤之一,其發(fā)病率在我國女性人群中排名第一。腫瘤轉(zhuǎn)移造成的死亡是乳腺癌最主要的致死原因。乳腺癌可以向多器官轉(zhuǎn)移,而肺、肝臟和骨是其最常轉(zhuǎn)移的部位,發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高于其他器官,是乳腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移的靶器官。乳腺癌為何更傾向于轉(zhuǎn)移到上述器官?在卡普蘭提出腫瘤前轉(zhuǎn)移理論之前,已有許多研究試圖對此行為背后的機(jī)制做出解釋,主要觀點(diǎn)有幾種,一是某個(gè)或某幾個(gè)基因的異常決定了腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為,二是基于配體受體和理論,認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的行為取決于腫瘤分泌的特異性細(xì)胞因子或受體與靶器官的相互作用,三是以上兩種理論的綜合。腫瘤前轉(zhuǎn)移理論為乳腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移的研究開啟了新的思路,近幾年來,已經(jīng)有越來越多的研究是基于腫瘤轉(zhuǎn)移前期的基礎(chǔ)之上,并逐漸驗(yàn)證了此理論的真實(shí)性。基于以往的研究,我們認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移前期靶器官微環(huán)境的炎癥反應(yīng)可能對乳腺癌的器官特異性轉(zhuǎn)移有重要作用。乳腺癌細(xì)胞定植到靶器官是一個(gè)復(fù)雜的過程,我們的研究所關(guān)注的是其中的某個(gè)關(guān)鍵步驟,即乳腺癌細(xì)胞在血液循環(huán)的過程中粘附并穿出血管的過程,并探索靶器官微環(huán)境的炎癥反應(yīng)對這一過程的影響。我們認(rèn)為這種影響可能體現(xiàn)在兩個(gè)方面,一是改變靶器官微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu),使細(xì)胞通透性增大,利于腫瘤細(xì)胞的穿出,二是原發(fā)腫瘤分泌的炎癥因子可能通過某種分子機(jī)制對血管壁產(chǎn)生影響,利于腫瘤的貼壁。這兩個(gè)假設(shè)是本實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ),而我們研究的最終目的就是驗(yàn)證假設(shè)真實(shí)性以及探索其背后可能的機(jī)制。第一部分4T1小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中靶器官發(fā)生轉(zhuǎn)移前期的炎癥反應(yīng)研究目的1.確定4T1小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型轉(zhuǎn)移前期發(fā)生的時(shí)間范圍。2.驗(yàn)證轉(zhuǎn)移前期小鼠肺部的炎癥反應(yīng)和通透性變化。3.驗(yàn)證轉(zhuǎn)移前期小鼠肝部發(fā)生局部炎癥反應(yīng)。研究方法1.建立4T1小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型：用BALB/c小鼠和4T1乳腺癌細(xì)胞建立小鼠乳腺癌原位轉(zhuǎn)移模型：使用6-8周的雌性BALB/c小鼠,每8-10只為一組；在小鼠第四對乳腺處皮下注射4T1細(xì)胞,每側(cè)5×105個(gè)。2. 確定乳腺癌腫瘤前轉(zhuǎn)移發(fā)生的時(shí)間范圍：初步確定乳腺癌前轉(zhuǎn)移發(fā)生的時(shí)間范圍：用BALB/c小鼠和4T1乳腺癌細(xì)胞建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型,自接種后一周起,每隔2-4天解剖一組小鼠,查看器官轉(zhuǎn)移情況。精確確定乳腺癌前轉(zhuǎn)移發(fā)生的時(shí)間范圍：用病毒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞,使其表達(dá)紅色熒光(RFP-4T1);將RFP-4T1細(xì)胞用上述方法種植在BALB/c小鼠乳腺,自接種一周起,每隔2-4天解剖一組小鼠,鏡下觀察組織冰凍切片,查看轉(zhuǎn)移情況。3. 檢測炎癥反應(yīng)：將組織器官切片進(jìn)行HE染色,鏡下觀察組織形態(tài)。4.血管通透性試驗(yàn)：通過尾靜脈向前轉(zhuǎn)移期的BALB/c小鼠體內(nèi)注射結(jié)合羅丹明的低分子右旋糖酐(rhodamine-conjugated dextran,70 kD),4 h后以同樣方法注射結(jié)合綠色熒光蛋白的凝集素(FITC-lectin),30 min后用生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗。灌洗完畢解剖小鼠,取出肺組織進(jìn)行冰凍切片,鏡下觀察并拍照。5. Western blot和熒光定量PCR法檢測緊密連接蛋白的表達(dá)。6. 用免疫熒光染色法檢測轉(zhuǎn)移前期小鼠肺部緊密連接蛋白分布：取前轉(zhuǎn)移期小鼠以及對照組小鼠的肺組織做成冰凍切片,免疫熒光染色后鏡下觀察。結(jié)果1.4T1小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型的生長過程：4T1細(xì)胞原位種植一周后,乳腺處長出約黃豆粒大小的原位瘤,肺部無明顯改變；10天后,原位瘤生長至蠶豆粒大小,部分小鼠肺部可見炎性改變；腫瘤種植后12天,半數(shù)小鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；種植腫瘤后14天,個(gè)別小鼠肺部可見轉(zhuǎn)移瘤；20天后,原位瘤體積明顯增大,多數(shù)小鼠肺部可見轉(zhuǎn)移瘤。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,我們將乳腺癌轉(zhuǎn)移前期初步界定在原位種植后第10-12天。將RFP-4T1細(xì)胞原位注射后,我們分別于第12天、第14天和第16天解剖小鼠并切片觀察,發(fā)現(xiàn)代表轉(zhuǎn)移瘤的紅色熒光斑最早出現(xiàn)在第14天的小鼠肺部,而HE染色顯示炎癥表現(xiàn)最早出現(xiàn)在第10天的小鼠肺部。2.轉(zhuǎn)移前期小鼠肺部通透性變化：結(jié)合羅丹明的低分子右旋糖酐可以穿過毛細(xì)血管的細(xì)胞間隙,滲透入血管周圍組織,在熒光顯微鏡下顯示紅色；結(jié)合綠色熒光蛋白的凝集素可以與血管壁結(jié)合,顯示血管結(jié)構(gòu)。對比轉(zhuǎn)移前組和對照組的肺部冰凍切片,可見轉(zhuǎn)移前組紅色熒光明顯增多。3.緊密連接相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)移前期的小鼠肺部的變化：檢測Occludin、ZO-1、 Claudin-5、Claudin-1和Claudin-4這幾種緊密連接蛋白的表達(dá)量在轉(zhuǎn)移前期小鼠肺部的變化。Occludin和ZO-1在轉(zhuǎn)移前期的小鼠肺部表達(dá)明顯減少；Claudin-5大量存在于小鼠肺組織中,但是其表達(dá)變化不明顯；Claudin-1和Claudin-4在小鼠肺組織中表達(dá)量較少,且變化并不明顯。粘附連接蛋白β-catenin、E-cadherin和VE-cadherin的表達(dá)無明顯變化。免疫熒光顯示Occludin和ZO-1在小鼠肺部存在異常分布。4.轉(zhuǎn)移前期小鼠肝臟出現(xiàn)炎癥反應(yīng)：植腫瘤后14天,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟發(fā)生鏡下改變,種植腫瘤后16天,部分小鼠的肝臟觀察到局部炎癥反應(yīng)。免疫組化顯示肝組織E-selectin染色陽性。結(jié)論1.4T1小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型,腫瘤轉(zhuǎn)移前期時(shí)間范圍被確定為4T1細(xì)胞原位種植后的第12天之前。2.組織HE染色和免疫組化染色證明轉(zhuǎn)移前期小鼠肺和肝臟存在局部炎癥反應(yīng)。3.血管通透性試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)移前期小鼠肺毛細(xì)血管通透性增加。4.緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和ZO-1在轉(zhuǎn)移前期小鼠肺部表達(dá)減少。5.轉(zhuǎn)移前期小鼠肝臟炎癥反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間晚于肺。免疫組化顯示轉(zhuǎn)移前期小鼠肝組織E-selectin染色陽性。第二部分探討轉(zhuǎn)移前期小鼠靶器官炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制研究目的1.驗(yàn)證轉(zhuǎn)移前期小鼠血清中是否存在某一種或幾種表達(dá)水平異常增高的細(xì)胞因子,而原發(fā)腫瘤的分泌是否是導(dǎo)致這種細(xì)胞因子血清水平增高的原因。2.分析此異常增高的細(xì)胞因子是否可能是導(dǎo)致前轉(zhuǎn)移期小鼠肺部緊密連接蛋白表達(dá)發(fā)生變化的原因。3.驗(yàn)證此細(xì)胞因子是否與前轉(zhuǎn)移期小鼠肺部毛細(xì)血管通透性增加有關(guān)。4. 驗(yàn)證緊密連接蛋白的表達(dá)異常是否會導(dǎo)致小鼠肺部毛細(xì)血管通透性增加。5.驗(yàn)證VEGF下游通路是否與肺內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化相關(guān)。研究方法1.用蛋白芯片和ELISA方法檢測轉(zhuǎn)移前期小鼠血清中細(xì)胞因子的水平。用Western blot檢測原發(fā)腫瘤內(nèi)部細(xì)胞因子的表達(dá)。ELISA方法檢測培養(yǎng)的4T1細(xì)胞中該細(xì)胞因子的表達(dá)情況。2.分離并體外培養(yǎng)BALB/c小鼠肺血管上皮細(xì)胞。3.用VEGF處理小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,用Western blot法檢測緊密連接蛋白的表達(dá)。用熒光定量PCR測定小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白相對應(yīng)的mRNA含量。用免疫熒光染色法觀察VEGF處理后小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)。4.通過transwell試驗(yàn),驗(yàn)證VEGF處理后小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性是否改變。應(yīng)用細(xì)胞因子抑制劑后,檢測前轉(zhuǎn)移期小鼠肺部毛細(xì)血管通透性的變化。5. VEGF處理小鼠肺血管內(nèi)皮后,用Western blot方法檢測各個(gè)下游通路變化情況。找出變化最明顯的通路,進(jìn)一步驗(yàn)證。加入通路抑制劑,驗(yàn)證該通路的激活與Z0-1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果1.用蛋白芯片和ELISA方法檢測了12種相關(guān)的細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)移前期組小鼠和對照組小鼠血清中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示和對照組相比轉(zhuǎn)移前期組小鼠血清中VEGF的水平明顯增高。ELISA方法檢測表明4T1乳腺癌細(xì)胞可以分泌大量VEGF。2. 用VEGF處理培養(yǎng)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平降低。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞爬片經(jīng)免疫熒光染色后顯示,VEGF處理組ZO-1熒光表達(dá)減少。3. transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示VEGF處理后的小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。4.對前轉(zhuǎn)移期小鼠應(yīng)用VEGF的抑制劑后,小鼠肺部毛細(xì)血管通透性降低。5. VEGF處理小鼠肺血管內(nèi)皮后,PKC通路活躍性增強(qiáng)。PKC通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)VEGF引起的ZO-1的表達(dá)下降。結(jié)論1.原發(fā)腫瘤可分泌VEGF并釋放入血液循環(huán),導(dǎo)致VEGF血清水平升高。2.血清VEGF水平升高導(dǎo)致前轉(zhuǎn)移期小鼠肺血管內(nèi)皮緊密連接蛋白特別是Z0-1表達(dá)減少,從而導(dǎo)致小鼠肺部毛細(xì)血管通透性增加。3. VEGF對ZO-1表達(dá)的影響可能通過PKC通路起到作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-37

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本文編號：2292174