【摘要】：惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤,生長(zhǎng)迅速,惡性程度高,病人預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在惡性膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá),且可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。GDNF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的一員,能夠通過(guò)與膜受體的結(jié)合,激活相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,但具體機(jī)制尚不清楚。目前已知GDNF的膜受體具有多樣性,在不同細(xì)胞中可能有不同的膜受體,進(jìn)而啟動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和最終的生物學(xué)效應(yīng)也不盡相同。本實(shí)驗(yàn)以大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系C6細(xì)胞作為研究對(duì)象,探索外源性給予GDNF引起C6細(xì)胞增殖的過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的膜受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及增殖相關(guān)的靶基因等,希望借此找到能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的可能的潛在性生物靶點(diǎn),從而改善膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后。目的探索在外源性給予GDNF促C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程中,GDNF的可能膜受體、相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及和增殖相關(guān)的靶基因。方法C6細(xì)胞克隆自N-亞硝基甲脲誘導(dǎo)的大鼠源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,再通過(guò)后續(xù)的體外培養(yǎng)和動(dòng)物傳代交替后形成,其應(yīng)用非常廣泛。本研究使用的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞/干細(xì)胞庫(kù)。1.常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞和正常原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,均選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè);流式細(xì)胞術(shù)確定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期同步化效果最佳的血清饑餓條件;CCK8實(shí)驗(yàn)確定外源性給予GDNF促C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的最佳作用濃度和時(shí)間點(diǎn),并使用流式細(xì)胞術(shù)和Ed U染色方法對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;2.收集C6細(xì)胞和原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,提取細(xì)胞膜蛋白;分別以GST和GST-GDNF融合蛋白作為誘餌,對(duì)膜蛋白進(jìn)行GST沉淀(pull-down)實(shí)驗(yàn),并進(jìn)一步利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)和基因本體學(xué)(gene ontology,GO)分析方法,篩選出可能和GDNF結(jié)合的蛋白;3.以篩選出的神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin-1,NRP1)作為進(jìn)一步研究對(duì)象。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色方法觀察NRP1在C6細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況;應(yīng)用Oncomine?平臺(tái)分析腦膠質(zhì)瘤和正常大腦芯片數(shù)據(jù)的NRP1m RNA表達(dá)水平;并使用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)外源性給予GDNF對(duì)于NRP1在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分布的影響;4.利用ZDOCK服務(wù)器進(jìn)行GDNF和NRP1之間的蛋白質(zhì)對(duì)接,提取二者間最佳對(duì)接模式;進(jìn)一步使用Py MOL軟件分析二者間相互作用的氫鍵和靜電相互作用;使用免疫共沉淀技術(shù)判斷NRP1和GDNF間是否能夠結(jié)合;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和Western Blot(WB)實(shí)驗(yàn)深入探討外源加入GDNF對(duì)NRP1的基因和蛋白水平的影響;5.構(gòu)建靶向大鼠NRP1基因的RNA干擾慢病毒載體,并感染C6細(xì)胞;分別在使用anti-NRP1抗體和NRP1干擾慢病毒處理的情況下,利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性給予GDNF的促C6細(xì)胞增殖作用;6.分別利用WB和PCR技術(shù)測(cè)試外源性GDNF對(duì)NRP1的蛋白質(zhì)表達(dá)和m RNA表達(dá)的影響;從c Bioportal下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的相關(guān)數(shù)據(jù),利用兩樣本秩和檢驗(yàn)、Cox回歸模型和Kaplan-Meier生存曲線分析NRP1過(guò)表達(dá)情況對(duì)患者生存和預(yù)后的影響;7.血清饑餓致C6細(xì)胞細(xì)胞周期同步化后,外源性加入GDNF,提取胞漿、胞核蛋白,WB實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色觀察β-catenin在胞漿、胞核中分布的變化;8.對(duì)上述提取的胞漿胞核蛋白用β-catenin抗體進(jìn)行免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP),再將富集所得的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,得到外源性給予/不給予GDNF情況下能夠和β-catenin結(jié)合的差異表達(dá)蛋白,繼而利用DAVID軟件進(jìn)行GO分析、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,以及利用STRING和Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interactions,PPIs)網(wǎng)絡(luò)分析(分析目標(biāo):差異表達(dá)蛋白以及GDNF、NRP1和CTNNB1);9.以分析篩選得到的Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)作為研究對(duì)象,進(jìn)行其和β-catenin之間的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。10.血清饑餓致C6細(xì)胞細(xì)胞周期同步化后,外源性加入GDNF 0、0.5、1和24 h時(shí),提取總RNA;進(jìn)行m RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,檢測(cè)外源性給予GDNF 0.5、1和24 h相較0 h時(shí)的差異表達(dá)基因,生物信息學(xué)篩選GDNF促增殖相關(guān)性基因,通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;11.以分析得到的CXC趨化因子配體1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1,CXCL1)作為研究對(duì)象,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)外源性GDNF是否增強(qiáng)了CXCL1啟動(dòng)子活性;生物信息學(xué)方法探尋能夠啟動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄的β-catenin的共轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果1.外源性GDNF能夠促進(jìn)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,最佳的作用濃度和時(shí)間點(diǎn)為40 ng/ml,48 h;2.膜蛋白提取并以Na/K ATP酶作為內(nèi)參驗(yàn)證無(wú)誤;GST沉淀聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)(全程相應(yīng)質(zhì)量控制)輔以GO本體學(xué)分析篩選能和GDNF結(jié)合的膜蛋白,結(jié)果顯示:和大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上特異的能夠和GDNF結(jié)合的膜蛋白有吸引素(Attractin,ATRN),NRP1和神經(jīng)纖毛蛋白2(neuropilin-2,NRP2)。3.利用Oncomine?平臺(tái)分析來(lái)自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)集的腦GBM與正常腦組織的m RNA表達(dá)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示NRP1、NRP2和整合素β-1(Integrin beta-1,ITGB1)表達(dá)顯著增加,而膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體α1(GDNF family receptor alpha 1,GFRA1)、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RET)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)、鈣粘著蛋白-2(Cadherin-2,CDH2)、多配體蛋白聚糖(Syndecan-3,SDC3)和ATRN沒(méi)有顯著差異;以篩選出的NRP1為進(jìn)一步研究對(duì)象;免疫熒光染色結(jié)果表明,與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,C6細(xì)胞中NRP1表達(dá)顯著增加;激光共聚焦技術(shù)顯示外源性給予GDNF可將更多的NRP1募集到C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上;4.利用ZDOCK服務(wù)器進(jìn)行GDNF和NRP1之間的蛋白質(zhì)對(duì)接,并用Py MOL軟件分析,結(jié)果顯示二者可以通過(guò)氫鍵和靜電穩(wěn)定相互作用;其中,GDNF的201號(hào)殘基與NRP1的殘基形成4個(gè)氫鍵;免疫共沉淀技術(shù)也證明NRP1和GDNF間能夠結(jié)合;5.構(gòu)建NRP1干擾慢病毒載體并感染C6細(xì)胞,并予以驗(yàn)證;在NRP1敲減或使用NRP1中和抗體的情況下,CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性GDNF促C6細(xì)胞增殖的作用減弱;6.WB和PCR實(shí)驗(yàn)顯示外源性GDNF誘導(dǎo)了C6細(xì)胞中NRP1的蛋白質(zhì)和m RNA表達(dá)水平增加;利用兩樣本秩和檢驗(yàn)、Cox回歸模型和Kaplan-Meier生存曲線分析從c Bioportal下載的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,NRP1 m RNA高水平組比其他患者的總生存期(overall survival,OS)和無(wú)病生存期(disease-free survival,DFS)都顯著降低;7.提取的胞漿、胞核蛋白分別以胞漿和胞核的參照物進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證無(wú)誤;WB實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示外源性GDNF作用后,β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯,核內(nèi)蛋白質(zhì)水平升高;8.IP聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GDNF作用下,核內(nèi)的Rac1等與β-catenin的結(jié)合量增多;生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示上調(diào)的差異表達(dá)蛋白的GO和KEGG主要富集于線粒體相關(guān)條目;而利用STRING和Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示Rac1可能在從NRP1到β-catenin的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞通路中發(fā)揮作用;9.免疫熒光共沉淀結(jié)果顯示:C6細(xì)胞中Rac1可以和β-catenin結(jié)合;10.外源性GDNF處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后提取總RNA,質(zhì)檢無(wú)誤;m RNA測(cè)序結(jié)果顯示外源性給予GDNF后不同時(shí)間段都有增殖相關(guān)性的CXC趨化因子配體1(C-X-C motif chemokine ligand 1,CXCL1)的基因CXCL1表達(dá)水平升高,RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果;11.熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示外源性GDNF增強(qiáng)了CXCL1啟動(dòng)子活性;生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NFκB)能作為β-catenin的共轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄。結(jié)論GDNF促膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖作用需要一個(gè)特定的跨膜受體來(lái)誘發(fā)胞內(nèi)信號(hào)。我們的研究結(jié)果表明跨膜蛋白NRP-1能夠和GDNF結(jié)合啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào),介導(dǎo)GDNF的促膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用,在此過(guò)程中,NRP1是GDNF的可能膜受體。當(dāng)GDNF-NRP1形成后,胞漿內(nèi)的Rac1-β-catenin被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)移,進(jìn)而促進(jìn)與增殖相關(guān)基因CXCL1的表達(dá)增加。至此,我們提出了GDNF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的一條可能的信號(hào)通路:GDNFNRP-1-β-catenin-CXCL1,關(guān)于這一通路的深入研究有望為膠質(zhì)瘤的治療提供潛在的藥物作用靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41
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本文編號(hào)：2286243