【摘要】：原發(fā)性肝癌是惡性度極高、預后極差、嚴重威脅國人生命健康的惡性腫瘤之一。研究顯示全世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝癌在實質(zhì)性腫瘤中的發(fā)病率排名第五,死亡率排名第三。原發(fā)性肝癌包括肝細胞肝癌、膽管細胞癌、肝血管肉瘤和肝母細胞瘤,其中最常見的是肝細胞肝癌,占原發(fā)性肝癌的80%以上。肝細胞肝癌與多種危險因素相關,如肝炎病毒、吸煙、黃曲霉污染的食物、酗酒、非酒精性脂肪肝、糖尿病、肥胖等。不同國家地區(qū)的主要危險因素各不相同,因此對肝癌的診斷、治療及預后的判斷造成了一定的困難。研究顯示近10年內(nèi)肝癌患者的5年生存率正在逐步提高,但是肝癌切除術后5年內(nèi)的轉(zhuǎn)移復發(fā)率仍高達61.5%。由于我國肝炎及肝硬化的患者人數(shù)眾多,因此我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。我國的肝癌患者約占全世界肝癌患者的50%,每年約有23萬人死于肝癌。全球每年約有60萬人因肝癌死亡,多數(shù)肝癌患者治療效果不佳,在確診后的一年之內(nèi)死亡,其主要原因包括確診時大多數(shù)患者已是肝癌晚期、腫瘤耐藥、腫瘤復發(fā)、侵襲血管及多發(fā)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等。對于那些復發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌患者采取的主要治療措施包括系統(tǒng)性化療和口服靶向治療藥物,如三氧化二砷和索拉非尼。雖然有研究表明一些關鍵分子參與調(diào)控肝癌細胞的增殖、凋亡、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移,但其分子機制仍不清楚。因此闡明關鍵蛋白參與調(diào)控肝癌細胞增殖、凋亡、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機制,有利于找出預測腫瘤增殖、耐藥的生物標記物,以及有效的治療靶點,對于腫瘤的早期診斷及有效的干預治療具有重要的研究價值與臨床意義。橋粒是具有中間纖維網(wǎng)絡的細胞間連接結構,近年來已證實橋粒主要由多種蛋白分子組成,包括糖蛋白以及斑塊相關蛋白,其中糖蛋白包括橋粒芯蛋白(desmoglein,dsg)和橋粒膠蛋白(desmocollin,dsc),它們均是鈣粘蛋白家族的成員,斑塊相關蛋白包括橋粒斑蛋白(desmoplakin,dp)、斑珠蛋白(plakoglobin,pg)和斑菲素蛋白(plakophilin,pp)。除此之外,一些輔助蛋白如橋粒鈣調(diào)結合蛋白和橋粒聯(lián)結蛋白,也參與橋粒的構成。橋粒相關蛋白可增加細胞間的粘著力以維持組織的完整性,同時,也是參與上皮形態(tài)發(fā)生、分化的關鍵調(diào)節(jié)因子。橋粒連接結構一旦被破壞,將會導致上皮組織起源的各類疾病。在某些特定的情況下,橋粒會發(fā)生功能的缺失或結構的改變,使細胞之間的粘附能力下降并發(fā)生形態(tài)學變化,這一系列的改變與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤新生血管的形成息息相關。橋粒相關蛋白pinin是一個分子量為140kda的磷酸化蛋白質(zhì),在細胞中分布廣泛,并具備多種功能。pinin首次在細胞間中間纖維匯合處的橋粒結構中被發(fā)現(xiàn),它與其它橋粒相關蛋白的相互作用有助于增加上皮細胞之間的粘附力,并降低細胞的遷移能力。除橋粒結構外,pinin也廣泛分布于核斑區(qū),參與mrna前體的剪切和mrna的轉(zhuǎn)運。pinin可以通過多種途徑調(diào)節(jié)細胞周期、癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥性。研究證實,在上皮起源的腫瘤中如腎癌與肺癌,pinin可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),在一些腫瘤組織或癌細胞系中pinin的表達下調(diào),但pinin是否會影響肝細胞肝癌的發(fā)生與發(fā)展目前尚不清楚。本研究分別在組織水平與細胞水平檢測了pinin在肝細胞肝癌中的表達情況,并利用分子生物學方法驗證了pinin對肝癌細胞克隆形成能力、增殖能力、細胞活力及葡萄糖剝奪誘導凋亡的調(diào)控作用,并初步探討了其可能的作用機制,以期找出預測腫瘤增殖、耐藥的生物標記物和有效的治療靶點。目的:探討橋粒相關蛋白pinin在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用及其可能的分子機制。方法:1.利用實時定量pcr和westernblot檢測肝癌組織、癌旁組織和正常組織pininmrna和蛋白表達水平的差異。2.利用免疫組化方法檢測組織芯片中肝細胞肝癌患者的癌組織及癌旁組織pinin蛋白表達水平的差異。3.利用實時定量pcr和westernblot檢測不同的肝癌細胞系及正常肝細胞系pininmrna和蛋白表達水平的差異。4.利用細胞計數(shù)和edu方法檢測敲低pinin對肝癌細胞增殖能力的影響。5.利用結晶紫染色法檢測敲低或過表達pinin對肝癌細胞克隆形成能力的影響。6.cck8檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中敲低pinin對肝癌細胞活力的影響。7.利用westernblot檢測葡萄糖剝奪對肝癌細胞pinin表達水平的影響。8.利用流式細胞技術和westernblot檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中敲低pinin對肝癌細胞凋亡的影響。9.利用流式細胞技術和westernblot檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中過表達pinin對肝癌細胞凋亡的影響。10.westernblot檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中,敲低或過表達pinin對細胞內(nèi)p-erk水平的影響。11.p-erk抑制劑u0126處理后,流式細胞技術檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中過表達pinin對肝癌細胞凋亡的影響。12.p-erk抑制劑u0126處理后,westernblot檢測葡萄糖剝奪環(huán)境中,過表達pinin對細胞內(nèi)p-erk水平的影響。結果:1.實時定量pcr和westernblot檢測顯示8例肝細胞肝癌患者中有6例肝癌組織pininmrna和蛋白的表達明顯高于癌旁組織及正常肝組織。2.30例患者中有25例癌組織中pinin的蛋白表達水平明顯高于癌旁組織,且pinin的表達與腫瘤的臨床分期相關。3.實時定量pcr和westernblot檢測顯示肝癌細胞中pininmrna和蛋白的表達明顯高于正常肝細胞。4.細胞計數(shù)和edu檢測顯示敲低pinin使肝癌細胞的增殖能力下降。5.結晶紫染色顯示敲低pinin使肝癌細胞克隆形成能力降低,而過表達pinin使肝癌細胞克隆形成能力升高。6.cck8檢測顯示葡萄糖剝奪環(huán)境中敲低pinin使肝癌細胞的活力下降。7.Western blot顯示葡萄糖剝奪可使肝癌細胞pinin的表達水平升高。8.流式細胞技術和western blot顯示葡萄糖剝奪環(huán)境中敲低pinin使肝癌細胞凋亡增加。9.流式細胞技術和western blot顯示葡萄糖剝奪環(huán)境中過表達pinin使肝癌細胞凋亡減少。10.Western blot顯示葡萄糖剝奪環(huán)境中,敲低pinin可促進肝癌細胞中p-ERK的去磷酸化,而過表達pinin可以抑制肝癌細胞內(nèi)p-ERK的去磷酸化。11.流式細胞技術顯示,p-ERK抑制劑U0126可以抑制葡萄糖剝奪后過表達pinin抑制肝癌細胞凋亡的作用。12.Western blot顯示p-ERK抑制劑U0126可以抑制葡萄糖剝奪后過表達pinin抑制肝癌細胞內(nèi)p-ERK去磷酸化的作用。結論:1.肝癌組織pinin mRNA和蛋白的表達明顯高于癌旁組織及正常肝組織,肝癌細胞中pinin mRNA和蛋白的表達明顯高于正常肝細胞,因此pinin可能與肝癌的發(fā)生密切相關。2.pinin表達升高增強肝癌細胞的克隆形成能力及肝癌細胞對無糖環(huán)境的耐受能力。敲低pinin使細胞活力、增殖能力及克隆形成能力下降,因此pinin對肝細胞肝癌的發(fā)展起促進作用。3.pinin通過調(diào)控ERK信號通路來影響葡萄糖剝奪誘導肝癌細胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2285499