【摘要】：研究背景及目的:在中國,食管癌在腫瘤致死率及惡性疾病中分別占第六位和第八位。盡管食管癌的診斷技術(shù)和治療方法不斷提高,但食管癌患者預(yù)后仍然很差,5年生存率只有17%,主要因?yàn)槭彻馨┰缙诎Y狀不明顯,大多數(shù)患者確診已是晚期階段。在中國,食管癌的主要病理類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。目前,導(dǎo)致食管癌的細(xì)胞及分子機(jī)制還未被詳細(xì)闡述,因此找到它的分子治療靶點(diǎn)非常重要。Maelstrom(MAEL)基因最初在果蠅的染色體上發(fā)現(xiàn),對精子形成、減數(shù)分裂及Piwi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子沉默發(fā)揮重要作用。在人體正常組織中,MAEL只表達(dá)在男性的睪丸生殖細(xì)胞中;后來的研究發(fā)現(xiàn)它在很多類型的腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象,而且有研究證實(shí)MAEL是一種新型的癌睪抗原,能夠受甲基化調(diào)控。目前,MAEL在人肝癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌的1q24位置被發(fā)現(xiàn),能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及轉(zhuǎn)移,與患者生存期密切相關(guān)。因此,MAEL作為免疫治療的靶點(diǎn)有很多的優(yōu)勢。目前,MAEL在食管鱗癌中的表達(dá)、功能及相關(guān)機(jī)制還未被研究。腫瘤微環(huán)境除了腫瘤細(xì)胞在此棲息之外,還有多種免疫抑制因子和免疫抑制細(xì)胞,它們能夠影響腫瘤的進(jìn)展。趨化因子IL-8(interleukin-8)在腫瘤微環(huán)境中是一種比較重要的免疫抑制因子,通過與MDSCs上的受體CXCR1/CXCR2結(jié)合招募?xì)脑葱砸种萍?xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)到腫瘤部位。MDSCs是腫瘤微環(huán)境中一種重要的免疫抑制細(xì)胞,能夠分泌多種免疫抑制因子,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本文旨在研究MAEL在食管鱗癌中的表達(dá)及功能,并分析它與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性,進(jìn)一步探討MAEL在食管鱗癌進(jìn)展中所涉及到的相關(guān)機(jī)制。第一部分Maelstrom在食管鱗癌患者中的表達(dá)及功能分析方法1)qRT-PCR方法檢測MAEL在食管鱗癌及對應(yīng)的癌旁正常組織的表達(dá)。2)分析MAEL表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。3)免疫組化檢測MAEL蛋白在食管鱗癌及對應(yīng)的癌旁正常組織的表達(dá)。4)分析MAEL表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。5)qRT-PCR檢測MAEL在食管永生化細(xì)胞系及多種食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)。6)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的MAEL過表達(dá)和敲低的載體分別轉(zhuǎn)染TE7和TE1細(xì)胞,qRT-PCR和Western blot檢測MAEL的表達(dá)。7)CCK8檢測過表達(dá)或敲低MAEL對食管癌細(xì)胞增殖的影響。8)低粘附板觀察MAEL過表達(dá)或敲低對食管癌細(xì)胞成球能力的影響。9)qRT-PCR檢測MAEL過表達(dá)或敲低對食管癌細(xì)胞干性的影響。10)建立裸鼠移植瘤模型,觀察過表達(dá)或敲低MAEL對裸鼠移植瘤生長的影響。結(jié)果1)MAEL m RNA在食管鱗癌組織的表達(dá)顯著高于對應(yīng)的癌旁組織,P0.05。2)MAEL m RNA的表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度相關(guān),P0.05。3)食管癌組織MAEL蛋白的表達(dá)高于對應(yīng)的癌旁組織。4)MAEL高表達(dá)組患者的無疾病生存率和總生存率低于MAEL低表達(dá)組,P0.05。5)應(yīng)用的細(xì)胞系均能檢測到MAEL m RNA的表達(dá),其中在TE7中表達(dá)最低,在TE1中表達(dá)最高,P0.05。6)qRT-PCR和Western blot檢測MAEL過表達(dá)或敲低的效率,即MAEL在m RNA及蛋白水平表達(dá)明顯升高或降低,P0.05。7)過表達(dá)或敲低MAEL,食管癌細(xì)胞的增殖能力明顯升高或降低,P0.05。8)MAEL過表達(dá)或敲低,促進(jìn)或抑制食管癌細(xì)胞的成球能力,P0.05。9)過表達(dá)或敲低MAEL,干性基因CD133、OCT4、Nanog及Notch1的表達(dá)明顯升高或降低,P0.05。10)在裸鼠移植瘤模型中,過表達(dá)或敲低MAEL,裸鼠腫瘤的形成能力、腫瘤體積和質(zhì)量升高或降低,P0.05。小結(jié)1)食管癌組織中MAEL的表達(dá)高于癌旁正常組織,且與患者的臨床病理參數(shù)及生存期相關(guān),MAEL可能是食管癌患者預(yù)后的一個指標(biāo)。2)MAEL過表達(dá)或敲低,食管癌細(xì)胞的增殖、自我更新能力及干性明顯升高或降低,提示MAEL在食管癌的惡性行為中發(fā)揮重要作用。3)MAEL過表達(dá)或敲低,在裸鼠模型中發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤的形成和發(fā)展的作用。第二部分Maelstrom通過調(diào)控Akt1/Rel A/IL-8信號通路招募MDSCs方法1)多因子檢測試劑盒、qRT-PCR及Elisa試劑盒檢測過表達(dá)或敲低MAEL對IL-8表達(dá)的影響。2)qRT-PCR檢測IL-8在食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá),并分析與MAEL的相關(guān)性。3)免疫組化檢測IL-8在食管鱗癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)。4)分析IL-8蛋白與食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。5)流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選后的MDSCs的純度6)Transwell檢測過表達(dá)或敲低MAEL,IL-8對MDSCs的招募,以及IL-8中和抗體處理后對MDSCs招募的影響。7)建立裸鼠移植瘤模型,在MAEL敲低的體系中,觀察IL-8對MDSCs招募的影響。8)Western blot和qRT-PCR檢測過表達(dá)或敲低MAEL以及用PI3k、Akt1及Rel A抑制劑處理后,Akt1、Rel A及IL-8蛋白表達(dá)的改變。9)MDSCs上清與食管癌細(xì)胞共孵育,qRT-PCR檢測MAEL、干性基因及EMT基因的表達(dá)。10)Elisa試劑盒檢測MDSCs上清中細(xì)胞因子的表達(dá)。11)qRT-PCR檢測TGF-β、IL-6及IL-10分別處理腫瘤細(xì)胞TE7后,MAEL、干性基因及EMT基因的表達(dá)。12)Western blot檢測TGF-β和(或)TGF-β抑制劑處理過的細(xì)胞中,MAEL、Smad2及Smad3的表達(dá)。結(jié)果1)過表達(dá)或敲低MAEL,IL-8的表達(dá)相應(yīng)的升高或降低,P0.05。2)在m RNA水平上,IL-8在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,并且與MAEL成正相關(guān),P0.05。3)食管鱗癌組織IL-8蛋白的表達(dá)高于對應(yīng)的癌旁組織,P0.05。4)IL-8蛋白高表達(dá)組患者的無疾病生存率和總生存率低于IL-8低表達(dá)組,P0.05。5)磁珠分選后,MDSCs的純度高于90%。6)過表達(dá)或敲低MAEL,IL-8對MDSCs的招募能力升高或下降,且IL-8中和抗體處理后對MDSCs的招募能力下降,P0.05。7)在裸鼠移植瘤模型中,MAEL敲低或應(yīng)用IL-8中和抗體處理細(xì)胞后,對MDSCs的招募能力下降,P0.05。8)過表達(dá)或敲低MAEL,p Akt1、p Rel A及IL-8蛋白和m RNA表達(dá)升高或降低,P0.05;PI3k、Akt1及Rel A抑制劑處理后,p Akt1、p Rel A及IL-8蛋白和m RNA表達(dá)降低,P0.05。9)MDSCs上清與腫瘤細(xì)胞共孵育后,MAEL、CD133、Nanog、Notch1、β-catenin、E-caderin、Fibro及Vimentin的表達(dá)水平明顯改變,P0.05。10)Elisa能夠檢測到MDSCs上清中TGF-β、IL-6、IL-10、IL-8及TNF-α蛋白的表達(dá)。11)TGF-β、IL-6和IL-10分別處理腫瘤細(xì)胞TE7,只有TGF-β處理的細(xì)胞,MAEL的表達(dá)升高,P0.05。12)TGF-β處理過的TE7和TE1細(xì)胞,MAEL、p Smad2及p Smad3蛋白的表達(dá)增加,P0.05;TGF-β抑制劑處理后,MAEL、p Smad2及p Smad3蛋白表達(dá)下調(diào),P0.05。小結(jié)1)在食管鱗癌組織中,IL-8的表達(dá)高于癌旁正常組織,且與MAEL的表達(dá)及患者的生存期相關(guān),提示IL-8可能作為食管癌患者預(yù)后的一個指標(biāo)。2)MAEL過表達(dá)或敲低,IL-8對MDSCs的招募能力升高或下降。3)在食管鱗癌中,MAEL調(diào)控IL-8是通過激活A(yù)kt1/Rel A信號通路實(shí)現(xiàn)的。4)MDSCs上清中的TGF-β能夠上調(diào)MAEL是通過激活Smad2/Smad3實(shí)現(xiàn)的結(jié)論1)MAEL在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,與患者的臨床參數(shù)及預(yù)后相關(guān),并且能夠影響食管癌細(xì)胞的增殖、自我更新能力及干性。2)MAEL通過激活A(yù)kt1/Rel A信號通路調(diào)控IL-8,招募MDSCs到腫瘤部位,MDSCs分泌的TGF-β通過激活Smad2/Smad3來調(diào)控MAEL。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Refined mapping of loss of heterozygosity on 1q31.1-32.1 in sporadic colorectal carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

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本文編號：2282923