【摘要】：研究背景肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的實體腫瘤,非小細胞肺癌(NSCLC)占總肺癌的80%,其病因至今尚不完全明確。近期研究表明,慢性炎癥在肺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此深入闡明慢性炎癥在肺癌發(fā)生發(fā)展過程的作用及機制將會有利于完善肺癌發(fā)展理論,也將會為肺癌防治提供新思路、新靶標。肺癌患者體內(nèi)可見補體的大量活化。腫瘤微環(huán)境中補體C5裂解產(chǎn)物可以通過誘導腫瘤形成免疫耐受,直接調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及介導內(nèi)皮細胞血管生成等方式促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展。然而肺癌患者體內(nèi)補體的活化途徑尚未闡明,這一機制的闡明將為靶向補體的肺癌防治提供有力的支持。腫瘤細胞可以通過異常表達組織因子(tissue factor, TF),獲得活化凝血系統(tǒng)的能力,引起肺癌、胰腺癌、胃癌等患者處于高凝狀態(tài),引發(fā)一系列靜脈血栓相關(guān)并發(fā)癥。近期有研究報道,凝血系統(tǒng)活化產(chǎn)物凝血酶、Ⅸ因子、Ⅹ因子和Ⅺ因子均可以直接裂解補體,引起補體的活化。但是在腫瘤微環(huán)境中尚無這一現(xiàn)象及其作用的報道。本課題著眼于探討在腫瘤微環(huán)境中腫瘤源性TF介導的凝血活化與補體系統(tǒng)的相關(guān)作用以及其在肺癌發(fā)展中的影響及機制。因此,該工作能夠完善腫瘤微環(huán)境中補體活化的理論,為肺癌的臨床治療研究提供新的思路研究方法1.檢測腫瘤細胞株TF表達及其對活化凝血能力的影響PCR檢測人肺腺癌細胞株A549、人乳腺癌細胞株T47D、人卵巢癌細胞株A2780、人胃腺癌細胞株AGS、人大細胞肺癌細胞株H460的TF表達水平。使用慢病毒下調(diào)A549細胞株TF表達,構(gòu)建A549-shTF細胞株及對照細胞株A549-vec; PCR和Western Blot檢驗TF下調(diào)程度。使用人乏血小板血漿檢測A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株誘導血漿凝固能力,檢測凝血酶原時間(prothrombin Time, PT)。2.分析下調(diào)TF表達對肺癌細胞株A549的生物學特性影響CCK-8檢測A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株體外增殖潛能;流式細胞術(shù)檢測A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株有絲分裂相關(guān)分子Ki-67表達水平;流式細胞術(shù)檢測A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株凋亡相關(guān)標記Annexin V和PI染色水平。3.下調(diào)TF對A549細胞株裸鼠體內(nèi)腫瘤生長及腫瘤微環(huán)境內(nèi)凝血水平的影響使用A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,觀察腫瘤生長;免疫組織化學(IHC)染色檢測腫瘤組織石蠟切片中TF表達水平和纖維素沉積程度。4.下調(diào)TF延緩A549細胞株移植瘤生長的機制研究IHC染色檢測腫瘤石蠟切片中補體活化產(chǎn)物C3b/iC3b/C3c和C5b-9沉積水平;流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織中CD 11 b+Gr-1 +髓系抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)浸潤比例;使用C5a受體拮抗劑干預MDSC向腫瘤組織中的募集,觀察A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株在裸鼠體內(nèi)移植瘤生長。研究結(jié)果1. TF的表達決定了腫瘤細胞活化凝血系統(tǒng)的能力PCR結(jié)果顯示人肺腺癌A549細胞株表達較高水平的TF;通過慢病毒下調(diào)A549細胞的TF表達并使用PCR、Western Blot驗證,構(gòu)建了穩(wěn)定的低表達TF的細胞株A549-shTF和對照細胞株A549-vec;體外誘導乏血小板血漿凝固實驗顯示A549細胞株和A549-vec細胞株具有相同的促凝活性,而A549-shTF細胞株的促凝活性明顯減弱。2. TF的表達不影響肺癌細胞的增殖潛能和凋亡比例CCK-8實驗顯示,A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株具有相同的體外增殖潛能;流式細胞術(shù)顯示:(1)A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株Ki-67表達水平相同,(2) A549細胞株、A549-shTF細胞株及A549-vec細胞株中Annexin V+PI-細胞比例相近。3.下調(diào)TF表達延緩肺癌細胞體內(nèi)腫瘤生長并減弱局部凝血活化程度A549-shTF細胞形成的裸鼠皮下移植瘤的體積和重量均小于A549-vec細胞株來源的裸鼠皮下移植瘤。同時,IHC染色顯示A549-shTF組腫瘤組織中TF的表達水平和纖維素沉積量小于A549-vec組。4. TF介導的補體活化增強了 MDSC向腫瘤組織的募集并促進腫瘤生長IHC染色顯示A549-shTF組腫瘤組織中補體活化產(chǎn)物C3b/iC3b/C3c和C5b-9沉積量低于A549-vec組;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示A549-shTF組腫瘤組織中MDSC細胞浸潤比例低于A549-vec組。拮抗C5a受體后,A549-vec組裸鼠皮下移植瘤的生長速度下降至與A549-shTF組相同,MDSC的浸入比例也下降至與A549-shTF組無差異。研究結(jié)論1.肺癌細胞株A549具有活化凝血系統(tǒng)的能力;TF是A549細胞活化凝血能力的關(guān)鍵分子。2.下調(diào)A549細胞的TF表達不會影響細胞在體外的增殖潛力和細胞的凋亡比例。3.下調(diào)TF的表達,延緩了肺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長速度,減弱了腫瘤微環(huán)境中的凝血活化程度。4.減少腫瘤組織中TF的表達能夠減輕腫瘤微環(huán)境中補體的活化并降低腫瘤組織中的MDSC的比例;拮抗C5a受體引起的MDSC的募集減少可以抵消腫瘤源性TF促進腫瘤生長的能力。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;CD59 Silencing via Retrovirus-Mediated RNA Interference Enhanced Complement-Mediated Cell Damage in Ovary Cancer[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年01期

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本文編號：2282645