【摘要】：第一部分TWIST下游與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因篩選目的:TWIST基因在多種腫瘤中存在高表達(dá),通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、凋亡抵抗等進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究旨在通過(guò)全基因組表達(dá)譜芯片等高通量技術(shù)篩選TWIST下游與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因,探討TWIST及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)NSCLC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。方法:通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)四株常用肺癌細(xì)胞中TWIST的表達(dá)豐度,選取TWIST表達(dá)豐度最低的細(xì)胞株,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)TWIST后細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化;通過(guò)全基因組表達(dá)譜芯片、PCR及基因功能高通量篩選方法獲得TWIST下游與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因。結(jié)果:實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,在常見(jiàn)的四種NSCLC細(xì)胞株(A549、H1299、H1975、H358)中,TWIST在A549及H1299細(xì)胞中高表達(dá),在H358細(xì)胞中中度表達(dá),在H1975細(xì)胞中低表達(dá)。劃痕及遷移實(shí)驗(yàn)顯示,TWIST的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了 H1975細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,TWIST過(guò)表達(dá)的H1975細(xì)胞中,根據(jù)|FC|大于1.3且P-value值小于0.05差異基因篩選條件,共獲得差異表達(dá)基因1297個(gè),其中上調(diào)589個(gè),下調(diào)708個(gè)。通過(guò)生物信息分析及PCR驗(yàn)證,初步選擇20個(gè)上調(diào)的基因(DUSP5、TNIP1、TMEM154、CCBE1、CYB5R2、MYEOV、NUAK2、RPS6KL1、PPIF、RIMS2、SYT7、ABHD5、CEP85、LST1、NFKBIE、HYI、POLR3G、SNHG12、UPP1、PXK)進(jìn)行轉(zhuǎn)移相關(guān)的高通量功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,在分別敲除SYT7和CEP85后,過(guò)表達(dá)TWIST的H1975細(xì)胞遷移能力顯著下降,敲除組與對(duì)照組的遷移距離之比分別為:0.12,0.35(p0.05),提示這兩個(gè)基因?yàn)楦咄亢Y選的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。結(jié)論:1.TWIST過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了肺癌H1975細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2.SYT7、CEP85可能作為T(mén)WIST下游與NSCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因,對(duì)TWIST及其下游基因功能的研究將有助于明確NSCLC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。第二部分SYT7在非小細(xì)胞肺癌中的作用及機(jī)制研究目的:細(xì)胞功能學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證第一部分獲得的可能的功能陽(yáng)性基因SYT7,以明確其在NSCLC中的作用,并探討相應(yīng)的作用機(jī)制。方法:實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SYT7在A549、H1299、H1975(TWIST過(guò)表達(dá)細(xì)胞株)及H125細(xì)胞中的表達(dá)豐度。shRNA干擾技術(shù)分別敲除H1975過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株(TWIST外源性高表達(dá))、H1299(TWIST內(nèi)源性高表達(dá))及A549細(xì)胞(TWIST內(nèi)源性高表達(dá))中的SYT7基因,Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)及尾靜脈裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SYT7敲除對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。MTT增殖實(shí)驗(yàn)和FACS細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SYT7敲除后A549細(xì)胞增殖及凋亡的變化,Western-blot檢測(cè)SYT7敲除后EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化。使用TCGA數(shù)據(jù)檢測(cè)SYT7在肺癌組織與正常肺組織中的表達(dá)、甲基化水平及與臨床預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)全基因組芯片實(shí)驗(yàn)篩選SYT7敲除后的下游差異基因,Western-blot驗(yàn)證部分差異基因的表達(dá)并初步探索SYT7發(fā)揮調(diào)控作用的可能機(jī)制。結(jié)果:實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,SYT7基因在TWIST過(guò)表達(dá)的H1975細(xì)胞中表達(dá)豐度為高表達(dá),在其余三株肺癌細(xì)胞中表達(dá)豐度為中度表達(dá)。Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,SYT7的敲除顯著抑制了肺癌H1975(TWIST過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株)、A549及H1299細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(p0.05)。SYT7敲除后顯著抑制了 A549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,同時(shí)上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cad的表達(dá),下調(diào)間葉細(xì)胞標(biāo)志物N-cad、Vimentin的表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示,SYT7在肺癌組織中高表達(dá),并與肺鱗癌患者的預(yù)后相關(guān)。與正常肺組織相比,肺腺癌中SYT7基因CpG島的甲基化水平更低(p0.05)。SYT7敲除后共獲得差異基因746個(gè)(|FC|2,P0.05),其中上調(diào)376個(gè),下調(diào)370個(gè),Western-blot驗(yàn)證DDX58、HMGB1、JUN、STAT1的蛋白表達(dá)差異與芯片結(jié)果一致。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示SYNCRIP等hnRNPs與EIF4G1、EIF4E等EIFs有著廣泛而密切的關(guān)系。結(jié)論:1.SYT7的敲除抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及EMT,并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,SYT7可被視為非小細(xì)胞肺癌新的致癌基因。2.SYT7在肺癌組織中高表達(dá),并與肺鱗癌患者的預(yù)后相關(guān),DNA甲基化修飾可能為SYT7在肺腺癌中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一。3.SYT7可能通過(guò)與SYNCRIP或其復(fù)合物的相互作用上調(diào)EIF4G1、EIF4E等EIFs的表達(dá),從而在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2276056