【摘要】：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟惡性腫瘤的最主要類型之一,其發(fā)病率居全球男性惡性腫瘤的第5位,占腫瘤相關死亡率的第3位。全世界每年肝細胞癌的新發(fā)病例大約60萬例,其中80%以上發(fā)生于南非及東亞地區(qū),而新發(fā)病例中的一半以上發(fā)生于我國。目前肝細胞癌的治療方法包括手術治療、肝移植、化療、射頻消融及介入栓塞等方法。但由于肝細胞癌的早期診斷困難、手術可切除率低及治療后復發(fā)率高等問題,這些方法的遠期療效并不理想。目前,腫瘤免疫治療已經(jīng)逐漸顯示出了它對包括肝細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤臨床試驗和治療方面的潛力及優(yōu)越性,并憑借其突破性的科學成就被《Science》評為2013年最重大的科學突破之首。人外周血T細胞中有約90-95%為αβT細胞,另有約5~10%為γδT細胞。Vγ9Vδ2T細胞為γδT細胞的主要亞群,大約占外周循環(huán)血中γδT細胞總數(shù)的50-95%,并且表達唯一的T細胞受體(T cell receptor,TCR)組合γ9TCR-δ2TCR。與αβT細胞不同的是,這類T細胞亞群能夠識別自身異常細胞或腫瘤細胞通過甲羥戊酸代謝途徑合成的小分子非肽類磷酸化抗原(phosphoantigens,PAgs),如異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosohate,IPP)。這一過程無抗原特異性,不依賴抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC),也不受主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen,MHC)的限制。Vγ9Vδ2 T細胞膜表面表達的2型NK家族膜蛋白D(NK group 2 member D,NKG2D)受體可識別多種腫瘤細胞表面表達的MHC-I類分子(MIC-A/B)和UL-16結(jié)合蛋白(UL-16 binding proteins,ULBPs)。同時此類細胞具有強大的殺傷功能,可經(jīng)由穿孔素(Perforin)顆粒酶(Granzyme)途徑及Fas/Fas L途徑殺傷多種腫瘤細胞,同時還可以分泌γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等多種細胞因子來增強抗腫瘤反應。GMP級的人工合成IPP或甲羥戊酸代謝抑制劑唑來膦酸(zoledronate,ZOL)與白介素-2(interleukin-2,IL-2)聯(lián)合使用可選擇性誘導外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的Vγ9Vδ2T細胞活化擴增,并已用于腫瘤患者的臨床Ⅰ期和Ⅱ期細胞免疫治療。Vγ9Vδ2T細胞可以識別并殺傷多種腫瘤細胞甚至腫瘤干細胞,并具有免疫治療肝細胞癌的潛力。調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells,Treg)可以強烈地抑制腫瘤和結(jié)核病患者血循環(huán)中γδT細胞的擴增能力并損害其免疫功能。已有多個實驗證實,在不同類型的腫瘤患者外周血中都有大量Treg聚集并大量浸潤入腫瘤微環(huán)境中,從而抑制了機體的抗腫瘤免疫反應。同時,亦有實驗發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者外周血和腫瘤微環(huán)境中有大量Treg浸潤,抑制了循環(huán)γδT細胞的瘤內(nèi)浸潤并直接介導了腫瘤浸潤的γδT細胞功能障礙,并且與肝細胞癌的不良預后相關。在利用γδT細胞免疫治療多種惡性腫瘤的實驗中發(fā)現(xiàn)Treg損害了外周血γδT細胞的體外擴增能力及免疫功能。此外,有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤γδT細胞的亞群之一γδT17細胞能促進人大腸癌的發(fā)生發(fā)展。另外亦有研究證實,在肝癌小鼠模型的腫瘤微環(huán)境中,來源于γδT細胞的白介素-17(interleukin-17,IL-17)促進了小鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展。肝細胞癌患者外周血γδT細胞的體外擴增能力及其與患者臨床病理特征之間的相關性、抑制性細胞Treg、γδT17細胞及抑制性細胞因子IL-17在γδT細胞體外擴增過程中的變化情況、以及如何促進γδT細胞腫瘤歸巢的相關實驗研究至今未見相關文獻報道。因此,根據(jù)已有研究結(jié)果及文獻報道,我們提出如下假設:1、Zol+IL-2是否能夠有效擴增不同臨床特征的肝細胞癌患者外周血的γδT細胞,擴增后的γδT細胞是否能有效殺傷不同的肝癌細胞株并有可能用于臨床免疫治療肝細胞癌;2、如果γδT細胞體外擴增效果差,其原因是否與患者的某些臨床病理特征相關;3、伴隨著γδT細胞的體外擴增,抑制性細胞Treg、γδT17細胞及抑制性細胞因子IL-17在培養(yǎng)體系中是否有變化;4、是否可以通過改變肝癌細胞的趨化因子表達譜,使其表達更多的有利于γδT細胞遷移歸巢的趨化因子,來達到增加γδT細胞瘤內(nèi)浸潤數(shù)量的目的。為證明以上假說,我們擬采用以下實驗方案:1、對比分析正常人與肝細胞癌患者外周血Vγ9Vδ2T細胞體外擴增前后的數(shù)量和功能,并與不同肝癌細胞株共培養(yǎng),證明肝細胞癌患者外周血γδT細胞經(jīng)體外擴增后能否有效殺傷肝癌細胞。2、分析γδT細胞體外擴增效果差與患者臨床病理特征的相關性;分析在γδT細胞體外擴增過程中Treg、γδT17細胞及IL-17的變化情況以論證其擴增后用于臨床使用的安全性。3、分析沉默Hep G2細胞的CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復合體亞基7(CCR4-NOT transcription complex,subunit 7,CNOT7)基因后,JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路中的信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)及其下游調(diào)節(jié)的趨化因子之一干擾素誘導蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)的變化情況,以及在體外分析IP-10的變化導致γδT細胞趨化能力的改變情況,并探討發(fā)生這一現(xiàn)象的可能機制。第一部分肝細胞癌患者外周血γδT細胞體外擴增能力分析目的:證明Zol+IL-2可否在體外有效刺激擴增肝細胞癌患者外周血γδT細胞。方法:在獲得患者及家屬知情同意后,83例肝細胞癌患者納入實驗組,15名健康獻血者作為對照組,使用Ficoll密度梯度離心法分別提取其外周血PBMC并計數(shù),隨后使用Zol+IL-2及GT-T551培養(yǎng)基擴增12-14天后,運用流式細胞儀測定并對比分析實驗組和對照組擴增前后的γδT細胞數(shù)量、Vγ9Vδ2T細胞所占比例、Vγ9Vδ2T細胞亞型比例、NKG2D、Perforin、Granzyme B、CD107a、IFN-γ及TNF-α陽性細胞所占比例,最后通過MTT法檢測γδT細胞對不同肝癌細胞株的體外細胞毒性。結(jié)果:擴增前后,患者Vγ9Vδ2T細胞占γδT細胞的比例與健康人相比沒有明顯降低。然而,擴增后,患者γδT細胞占總T細胞的比例和Vγ9Vδ2T細胞占γδT細胞比例明顯增加。在細胞亞型方面,擴增后,Tna?ve和TEMRA細胞的構成比和數(shù)量明顯降低,TEM細胞的構成比明顯增加。另外,擴增后患者NKG2D+γδT細胞數(shù)量明顯增加,達到與健康人相似的水平。在分泌和殺傷功能方面,擴增后患者Perforin+γδT細胞的百分比有所下降,明顯低于健康人;Granzyme B+γδT細胞百分比在擴增后明顯增加。在本實驗中,擴增沒有明顯影響到CD107a和IFN-γ。另外,在患者外周血中,TNF-α+γδT細胞的百分比明顯比健康人高,而且擴增對這一細胞群沒有明顯的影響。此外,MTT法分析擴增后的γδT細胞對不同肝癌細胞株的細胞毒活性,在不同的效靶比下,γδT細胞對四株不同的肝癌細胞株均有明顯的殺傷毒性。另外,對Hep G2和PLC細胞株,隨著效靶比的增加,其細胞毒性也明顯增加。結(jié)論:Zol+IL-2能在體外夠有效擴增肝細胞癌患者外周血的γδT細胞,擴增后的γδT細胞能有效殺傷不同的肝癌細胞株并有可能用于臨床免疫治療肝細胞癌。第二部分γδT細胞體外擴增能力與臨床病理特征相關性及抑制性因素在擴增中變化的分析目的:探究影響肝細胞癌患者外周血γδT細胞體外擴增的因素,以及擴增過程中抑制性細胞和細胞因子的變化情況。方法:取得書面知情同意后,搜集83例患者詳細臨床資料并統(tǒng)計各數(shù)據(jù),運用流式細胞儀檢測擴增前患者和健康獻血者外周血中Treg和γδT17細胞的數(shù)量。另外,運用流式細胞儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗分析在擴增過程中培養(yǎng)體系里γδT17細胞和Treg的數(shù)量,以及γδT細胞培養(yǎng)上清中IL-17的變化情況。以健康獻血者數(shù)據(jù)為對照,分析γδT細胞的體外擴增能力與患者臨床病理特征之間的相關性,以及擴增對抑制性細胞及細胞因子的影響。此外還分析了培養(yǎng)體系中添加的10%自體血清中所含AFP與擴增后γδT細胞數(shù)量之間有無相關性。結(jié)果:γδT細胞擴增的質(zhì)量與患者的某些臨床病理特征相關。在臨床病理數(shù)據(jù)方面,通過單變量分析,擴增的質(zhì)量明顯與臨床BCLC分期、AFP水平、白蛋白,腫瘤的大小和數(shù)量、患病時間、動脈化療栓塞、Treg和γδT17細胞的數(shù)量及IL-17的水平相關。多因素分析顯示,AFP水平、Treg和γδT17細胞數(shù)量是與低質(zhì)量擴增有關的獨立因素,而患病時間則是與高質(zhì)量的擴增有關的獨立因素。伴隨著γδT細胞的體外擴增,培養(yǎng)體系中Treg和γδT17細胞的數(shù)量及培養(yǎng)上清中IL-17的水平未發(fā)生明顯改變。此外,培養(yǎng)體系中添加的10%自體血清中所含AFP與擴增后γδT細胞數(shù)量之間無相關性。結(jié)論:肝細胞癌患者外周血γδT細胞體外擴增能力與AFP水平、Treg和γδT17細胞數(shù)量及患病時間相關。擴增后的γδT細胞中抑制性細胞和細胞因子沒有明顯增加,可以安全用于肝細胞癌患者的臨床免疫治療。第三部分靶向沉默CNOT7促進γδT細胞趨化的體外實驗及機制分析目的:分析體外擴增前后γδT細胞表面趨化因子受體CXCR3的變化情況。分析靶向沉默Hep G2細胞的CNOT7基因后,STAT1及其調(diào)控的趨化因子IP-10的變化情況,以及對擴增后的肝細胞癌患者γδT細胞體外趨化能力的改變及其可能機制。方法:首先運用流式細胞儀分析擴增前后γδT細胞表面CXCR3的表達情況;隨后通過RNAi技術靶向沉默Hep G2細胞株的CNOT7基因,通過real-time PCR分析基因沉默前后STAT1 m RNA的表達情況,蛋白免疫印跡法分析STAT1及p-STAT1的表達情況;利用ELISA方法分析不同組別Hep G2細胞培養(yǎng)上清中IP-10的變化情況。最后通過趨化實驗(Chemotaxis assay)分析沉默CNOT7前后Hep G2細胞培養(yǎng)上清對γδT細胞趨化能力的變化情況及其可能的機制。結(jié)果:擴增后患者CXCR3+γδT細胞的比例有所上升。沉默CNOT7后,Hep G2細胞STAT1的m RNA的表達增加,STAT1和p-STAT1蛋白表達增加,IP-10的分泌水平增加,Hep G2細胞培養(yǎng)上清對擴增后的肝細胞癌患者γδT細胞趨化作用加強。結(jié)論:靶向沉默Hep G2細胞的CNOT7基因可以通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路,使STAT1表達增加,并進一步調(diào)節(jié)其下游靶點IP-10,促進IP-10合成分泌增加,增加的IP-10在體外能促進擴增后的γδT細胞向肝癌細胞遷移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2274408