發(fā)布時間：2018-10-13 12:24

【摘要】：背景肺癌是目前中國死亡率最高的癌癥。抽煙、環(huán)境污染的加劇等均是加大患肺癌風(fēng)險的危險因素。而活性氧(reactive oxygen species,ROS)在上述條件下表達(dá)量均上升。NADPH氧化酶NOX(non-phagocytic cell oxidase,NOX)是非吞噬細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的主要來源,生理情況下其產(chǎn)生的活性氧作為第二信使傳遞細(xì)胞內(nèi)的各種信號通路,但在外界各種因素如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等的刺激下表達(dá)量升高,產(chǎn)生大量活性氧,對細(xì)胞和機(jī)體造成一系列的影響。目前有研究表明NOX1在許多腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)量相對升高,這其中包括非小細(xì)胞肺癌。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK),當(dāng)受到外界的刺激后,JNK被磷酸化激活從而參與細(xì)胞凋亡信號通路。研究證實(shí),NOX1產(chǎn)生的ROS能夠調(diào)節(jié)JNK的活化水平。因此研究NOX1在肺腺癌A549細(xì)胞增值與凋亡中發(fā)揮的作用顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)首先通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染特異性的NOX1小干擾RNA(Small interference RNA,si RNA)抑制A549細(xì)胞中NOX1的表達(dá),觀察細(xì)胞ROS水平的改變及增殖活性和凋亡率的變化,再采用TNF-α刺激A549細(xì)胞,檢測不同組別細(xì)胞凋亡率的改變,以及NOX1、p-JNK和相應(yīng)的ROS的表達(dá)量的改變。通過上述實(shí)驗(yàn)來研究NOX1在A549細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮的作用,從而為NOX1在肺癌中的的作用提供理論依據(jù)。方法1實(shí)驗(yàn)方法1.1分別設(shè)置Mock組、NC組和NOX1si RNA組,觀察抑制NOX1表達(dá)對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測不同組別NOX1m RNA的表達(dá)量。為檢測TNF-α刺激A549細(xì)胞后NOX1表達(dá)量的改變,設(shè)置空白對照組、TNF-α組和TNF-α+NOX1si RNA組。1.2細(xì)胞增殖活性檢測:轉(zhuǎn)染12 h后對Mock組、NC組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),自轉(zhuǎn)染后12 h開始直至48 h之內(nèi),每隔12h分別檢測不同組別在492nm處的光密度值。1.3細(xì)胞活性氧的測定:轉(zhuǎn)染24h后對不同組別采用DCFH-DA標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測其熒光值。1.4細(xì)胞相應(yīng)蛋白表達(dá)量的檢測:轉(zhuǎn)染NOX1si RNA至細(xì)胞48 h以后,提取不同組別細(xì)胞的蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),內(nèi)參蛋白為β-actin,所得結(jié)果采用Quantity One軟件分析不同組別蛋白相對表達(dá)量。1.5細(xì)胞凋亡率的檢測:抑制NOX1表達(dá)的48 h后,消化不同組別的細(xì)胞并吹打混勻成單細(xì)胞懸液,Annexin-V-FITC、PI雙染法處理細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測不同組比細(xì)胞的凋亡率。2統(tǒng)計方法:采用SPSS 21.0對不同組別數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用單因素方差分析比較三組的均數(shù)之間的差異,兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。結(jié)果1.轉(zhuǎn)染NOX1si RNA對NOX1在A549細(xì)中表達(dá)的干擾效果:NOX1m RNA表達(dá)量與Mock組相比下降了約78%;NOX1蛋白的表達(dá)量與Mock組相比下降了約70%。2.抑制NOX1表達(dá)對A549細(xì)胞增殖活性的影響:與Mock組相比較,NOX1si RNA組細(xì)胞在24 h、36 h和48 h的增殖活性均下降(P0.05)。3.ROS表達(dá)量的改變:與Mock組相比,NOX1si RNA組的ROS水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比較,TNF-α組的ROS水平升高;與TNF-α組相比,TNF-α組+NOX1si RNA組的ROS水平下降;與空白對照組相比,TNF-α組+si RNA組的ROS水平升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.Western blot:NOX1組的p-JNK表達(dá)量與Mock組和NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比,TNF-α組的NOX1與p-JNK表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與TNF-α相比,TNF-α組+NOX1si RNA組的NOX1與p-JNK表達(dá)量均下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.抑制NOX1表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡率的影響:NOX1si RNA組細(xì)胞早期凋亡率與NC組和Mock組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而與TNF組相比,TNF-α組+NOX1si RNA組細(xì)胞凋亡率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論si RNA抑制NOX1表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞的增殖活性;采用TNF-α刺激A549細(xì)胞后NOX1的表達(dá)量升高,在此基礎(chǔ)上抑制NOX1的表達(dá)能夠降低應(yīng)激狀態(tài)下A549細(xì)胞的凋亡,且該過程伴隨著ROS和p-JNK表達(dá)量的改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2268617