【摘要】：目的：以97例肝細胞癌組織標本為基礎,結合病人的臨床資料和預后隨訪資料,研究miR-630在肝癌組織中的表達情況,探討miR-630的表達與肝癌病人臨床病理參數及手術預后的關系。方法：連續(xù)選取2010年1月至2012年12月間在華中科技大學附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心手術切除的肝細胞癌組織97例,全部標本均經過病理科組織學確診,結合肝癌病人臨床病理參數及預后隨訪進行分析。結果：結合臨床資料顯示：miR-630的表達與肝癌轉移,包膜完整性,腫瘤的分化程度(Edmonson分級),腫瘤的TNM分期,腫瘤的BCLC分期分級相關。將97例肝癌組織表達miR-630從高到低排序,以中位數為界,高于中位數的歸為高表達組,反之歸為低表達組。結合隨訪資料分析顯示,miR-630表達水平相對高的病人較之表達水平相對低的病人具有更低的復發(fā)率和更長的總體生存時間。四個表卡方檢驗顯示：miR-630的表達與AFP水平,腫瘤數目,血管侵襲,Edmonson分級,BCLC分期呈負相關。單因素分析顯示：miR-630的表達水平的降低是一個評估肝癌病人手術切除治療后復發(fā)和生存時間的一個顯著而獨立的危險因素。結論：miR-630相對高表達的肝癌病人提示可能具有較低的轉移概率和較好的預后。目的：這部分以中等轉移潛能的肝癌細胞系為研究工具,通過轉染miR-630的模擬物mimics或者miR-630的抑制物來研究miR-630對肝細胞癌生物學行為的影響。方法：瞬時轉染mimics或inhibitors,在轉染后的5天內進行細胞功能學實驗。如：用CCK-8實驗,探討miR-630對細胞增值能力的影響;用Transwell實驗,細胞劃痕實驗,探討miR-630對細胞遷移或者侵襲能力的影響；用免疫熒光實驗,探討miR-630對細胞形態(tài)及上皮間質樣轉化的影響。以慢病毒為工具構建穩(wěn)定的miR-630敲減的細胞系,用裸鼠皮下成瘤模型,在動物實驗中探討miR-630對肝癌致瘤性的影響;用裸鼠肝臟原位種植模型,探討miR-630對肝癌轉移的影響。結果：在中等轉移潛能的細胞中,無論是轉染miR-630 mimics還是inhibitors細胞的增值能力都沒有發(fā)生改變。轉染miR-630 mimics的細胞,遷移,侵襲能力都減弱,細胞形態(tài)更上皮化；而轉染了inhibitors的細胞遷移,侵襲能力都增強,細胞發(fā)生了間質樣的改變。在動物實驗中,細胞穩(wěn)定敲減miR-630并沒有改變肝癌細胞系的致瘤能力；然而卻增強了肝癌細胞系肝內轉移及肺轉移的能力。結論：miR-630能抑制肝癌細胞的遷移,侵襲,上皮間質樣轉化以及轉移,而對增值能力沒有影響。目的：探討miR-630在肝癌中通過抑制何種可能的癌基因調控肝癌惡性生物學行為的。方法：用生物信息庫預測miR-630的靶基因；熒光素酶報告基因轉錄分析,免疫組化,Western blotting, RT-PCR檢測Slug是否為miR-630的靶基因。用Transwell,劃痕,細胞免疫熒光實驗,Western blotting, RT-PCR在功能學角度驗證miR-630通過靶向抑制Slug從而抑制肝細胞癌的遷移,侵襲,上皮間質樣轉化。結果：熒光素酶報告基因轉錄分析顯示miR-630能結合Slug mRNA 3'UTR端;免疫組化相關性分析顯示肝癌組織中miR-630的表達與Slug呈負相關；Western blotting, RT-PCR檢測顯示miR-630能抑制Slug的表達,以及抑制上皮間質樣轉化相關的間質樣標記物；Transwell,劃痕實驗顯示抑制Slug能逆轉miR-630 inhibitors導致的遷移,侵襲能力增強；細胞免疫熒光實驗,Western blotting, RT-PCR檢測顯示抑制Slug能逆轉miR-630 inhibitors導致的上皮間質樣轉化相關的標記物表達改變。結論：miR-630在肝細胞癌中通過靶向抑制Slug調控其遷移,侵襲,上皮間質樣轉化。目的：研究調控miR-630的上游信號通路方法：利用RT-PCR檢測TGF-β對miR-630表達的影響；用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) and Jaspar (http://jaspar.genereg.net/)數據庫預測可能的抑制miR-630轉錄的結合位點；用熒光素酶報告基因轉錄分析判斷調控miR-630轉錄的核心序列；用染色質免疫共沉淀法(CHIP)驗證SP1, c-jun與相應轉錄結合位點結合；用熒光素酶報告基因轉錄分析探討該核心序列是否能調控miR-630轉錄；用RT-PCR驗證SP1, c-jun 在 miR-630表達過程中發(fā)揮的作用；用Western blot探討SP1, c-jun能否間接上調miR-630的靶基因Slug。從功能學回復實驗角度驗證TGF-β是抑制miR-630表達的上游調控因子。如：用Transwell實驗,劃痕實驗,驗證miR-630逆轉TGF-β刺激導致的細胞遷移,侵襲能力增強；細胞免疫熒光實驗,Western blot, RT-PCR實驗,驗證miR-630逆轉TGF-β刺激導致的上皮間質樣轉化。結果：用濃度為5ng/ml TGF-β培養(yǎng)基處理Bel7402, HL, PT-PCR檢測示miR-630表達在24小時內呈時間依賴性降低；用TGF-β Smad, non-Smad信號通路抑制劑配合TGF-β聯合處理細胞,RT-PCR結果檢測示Erk, JNK, P38信號通路抑制劑可上調miR-630表達；NCBI和Jaspar數據庫預測顯示miR-630轉錄起始位點上游lkb堿基序列包含多個Erk, JNK, P38信號通路下游細胞因子結合位點；熒光素酶報告基因轉錄分析檢測示miR-630轉錄起始位點上游79bp為調控miR-630轉錄的重要序列：染色質免疫共沉淀法(CHIP)驗證結果示：該79bp可結合SP1, c-jun,其分別為Erk,JNK信號通路下游細胞因子；熒光素酶報告基因轉錄分析再次驗證該79bp為為調控miR-630轉錄的重要序列,并且SP1, c-jun結合位點為阻遏蛋白結合序列；RT-PCR結果示：SP1, c-jun在TGF-β下調miR-630表達中起重要作用；Western blot結果證明抑制SP1, c-jun,能部分逆轉TGF-β誘導的Slug表達上調；Transwell,劃痕實驗顯示抑制miR-630 mimics能逆轉TGF-β導致的遷移,侵襲能力增強；細胞免疫熒光實驗,Western blotting, RT-PCR檢測顯示抑制miR-630 mimics能逆轉TGF-β導致的上皮間質樣轉化及相關的標記物表達改變。結論：TGF-β通過激活其下游的Erk/SP1,JNK/c-jun信號通路抑制miR-630表達,從而調控肝癌細胞的生物學行為。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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