【摘要】：【研究背景與目的】肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高、致死數(shù)最多的惡性腫瘤,肺癌的治療是醫(yī)學領域所關(guān)注的重要內(nèi)容之一。但長期以來,肺癌治療藥物的總體有效率和患者的生存指標均無明顯提高,尋找新的治療策略成為肺癌研究領域的重要方向。近年來,血管靶向抑制治療成為新的研究突破口。目前,已有一些血管靶向藥物被應用于肺癌的臨床治療,比如人源化抗VEGF-A單克隆抗體貝伐單抗以及小分子VEGFR-2抑制劑索拉非尼和舒尼替尼,但由于這些藥物對患者總生存期的改善作用并不明顯,且價格偏高,在一定程度上限制了其在臨床中的應用。三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)在我國首先被應用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療,可使急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者獲得較高的完全緩解率,且無明顯的骨髓抑制等副作用,表現(xiàn)出低毒、高效的抗腫瘤作用,被美國FDA批準用于治療APL。后來研究人員發(fā)現(xiàn),As2O3對包括乳腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌和基底細胞癌等在內(nèi)的多種實體瘤亦具有治療作用,我國藥監(jiān)局已于2004年批準As2O3單藥用于治療晚期肝癌。在肺癌領域,已有研究者就As2O3對肺癌細胞的抑制作用進行探討,但多數(shù)僅限于體外水平的研究。本人所在課題組前期率先將As2O3應用于治療晚期肺癌患者惡性胸腔積液的臨床探索,發(fā)現(xiàn)As2O3胸腔內(nèi)注射能明顯減少患者的惡性胸水量,并使胸水顏色逐漸由血性變?yōu)榈S色。這提示As2O3在肺癌治療中具有潛在的應用價值,但目前尚缺乏全身系統(tǒng)性應用As2O3對肺癌抑制效果的體內(nèi)實驗證據(jù)。As2O3對肺癌抑制作用的機制尚不明確,結(jié)合在其他腫瘤中的研究結(jié)果,可能的作用機制包括:抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化和凋亡、降低端粒酶活性等。越來越多的證據(jù)表明,As2O3具有抑制新生血管生成的特殊作用,這可能是其抗腫瘤效應的重要原因之一。體外研究發(fā)現(xiàn),As2O3可在基質(zhì)膠(Matrigel)成管實驗中抑制VEGF誘導的內(nèi)皮細胞形成管腔結(jié)構(gòu),且抑制效果呈劑量依賴性。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),在胃癌皮下移植瘤模型中,以2.5或5.0 mg/kg As2O3腹腔注射處理,可減少移植瘤的腫瘤血管密度及VEGFR表達量,且高劑量組比低劑量組減少更為明顯;在纖維肉瘤小鼠模型中,以2.0 mg/kg的As2O3皮下注射,可減低腫瘤內(nèi)不規(guī)則微血管的血流速度,致腫瘤中央血管閉鎖,而未發(fā)現(xiàn)As2O3對正常組織內(nèi)的血管有影響。本人所在課題組前期發(fā)現(xiàn),在小鼠肺癌胸膜轉(zhuǎn)移模型中,As2O3通過降低VEGF的水平,減少胸膜毛細血管的通透性,并抑制惡性胸腔積液的形成,提示血管抑制可能是As2O3對肺癌發(fā)揮治療作用的重要環(huán)節(jié)。目前關(guān)于As2O3對肺癌血管調(diào)控作用的相關(guān)研究很少,As2O3在體內(nèi)對肺癌血管生成是否具有調(diào)控作用仍然是一個未知的問題,As2O3對腫瘤新生血管調(diào)控機制的相關(guān)實驗證據(jù)也比較缺乏。本研究首先擬通過體內(nèi)實驗確定As2O3對不同病理類型肺癌移植瘤的生長及肺癌新生血管的抑制作用,以及對移植瘤組織VEGF和Dll4-Notch通路相關(guān)因子表達的影響;然后通過一系列體外實驗,觀察As2O3對肺癌血管新生過程多階段(內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞遷移、管腔結(jié)構(gòu)形成)的影響;最后,以內(nèi)皮細胞為研究對象,研究Dll4-Notch介導As2O3抑制血管管腔形成的作用機制,并檢測臨床患者肺癌組織中Dll4-Notch通路相關(guān)因子的表達情況。希望通過本研究,為As2O3抑制肺癌的作用提供實驗證據(jù),對As2O3的肺癌新生血管調(diào)控機制做出進一步論證,并探討As2O3在肺癌治療中的應用前景�！狙芯績�(nèi)容與方法】第一部分三氧化二砷對肺癌移植瘤生長及新生血管的抑制作用分別利用人肺腺癌細胞系、人大細胞肺癌細胞系以及人小細胞肺癌細胞系構(gòu)建肺癌皮下移植瘤裸鼠模型;鏡下觀察各移植瘤組織是否符合腺癌、大細胞癌和小細胞癌的病理特征。造模成功后用2.5 mg/kg和5.0 mg/kg的As2O3進行干預,以血管靶向抑制劑索拉非尼作為對照藥物,以生理鹽水作為空白對照,比較各組腫瘤體積和腫瘤生長抑制率;利用CD31熒光抗體對移植瘤組織切片進行染色,比較各組腫瘤組織中新生血管的數(shù)量及形態(tài);利用電鏡觀察As2O3對移植瘤新生血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。利用免疫熒光、Western Blot和定量PCR等方法,檢測各組移植瘤中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1等因子在蛋白水平或m RNA水平的表達情況。為更好地在體內(nèi)觀察新生血管的形態(tài),我們構(gòu)建了人肺腺癌A549細胞與基質(zhì)膠(Matrigel)混合移植模型。以不同濃度的As2O3進行干預,通過Masson染色,觀察各組移植瘤組織毛細血管內(nèi)的紅細胞數(shù)量;利用CD31熒光抗體進行染色,觀察比較各組腫瘤組織中新生血管的數(shù)量及形態(tài)。第二部分三氧化二砷對肺癌新生血管生成過程多階段的抑制作用:抑制內(nèi)皮增殖、遷移和管腔形成分別用不同濃度的As2O3處理NSCLC細胞系A549、SCLC細胞系NCI-H446和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),以血管抑制劑索拉非尼作為對照藥物,以生理鹽水作為空白對照。利用CCK-8實驗檢測各組細胞的增殖情況;通過細胞劃痕修復實驗檢測各組HUVECs的遷移能力;通過Matrigel體外成管實驗觀察各組HUVECs形成血管網(wǎng)絡的能力。利用Western blot和定量PCR,觀察血管生成各階段(內(nèi)皮遷移、增殖及成管)所涉及的促血管因子及其受體在各組細胞中的表達情況,包括MMP-2、MMP-9、PDGF-BB/PDGFR-β、VEGF-A/VEGFR-2、b FGF/FGFR-1和Dll4/Notch-1。第三部分Dll4-Notch介導三氧化二砷抑制內(nèi)皮細胞成管的作用機制研究首先,構(gòu)建Dll4過表達慢病毒和Notch-1干擾慢病毒,并利用這兩種慢病毒及相應的陰性對照慢病毒感染HUVECs細胞,再以As2O3進行干預,以生理鹽水作為空白對照,觀察各組內(nèi)皮細胞在Matrigel上的管腔形成能力,并檢測各組細胞Dll4、Notch-1及其下游靶基因Hes-1的表達水平。最后,利用免疫組化方法檢測臨床肺癌患者手術(shù)標本腫瘤組織與癌旁組織中Dll4-Notch通路和VEGF通路相關(guān)因子的表達情況�！狙芯拷Y(jié)果】第一部分三氧化二砷對肺癌移植瘤生長及新生血管的抑制作用1、As2O3能抑制裸鼠肺腺癌、大細胞癌、小細胞癌皮下移植瘤的生長,且呈劑量依賴性。干預結(jié)束時,As2O3處理組和索拉非尼組的腫瘤平均體積均小于生理鹽水組。肺腺癌模型中,As2O3 2.5 mg/kg組、As2O3 5.0 mg/kg組和索拉非尼組的腫瘤生長抑制率(TGI)分別是28.8%、42.4%和64.9%;肺大細胞癌模型中,3組的TGI分別是71.1%、84.9%和87.2%;肺小細胞癌模型中,3組的TGI分別是27.7%、56.8%和49.1%。2、對移植瘤組織切片用CD31抗體進行免疫熒光染色以顯示血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示:三種病理類型的肺癌移植瘤中,As2O3處理組的新生血管密度較對照組明顯減少,且血管的管腔結(jié)構(gòu)少于對照組。3、在肺癌細胞和Matrigel混合移植模型中,剝離抑制體觀察大體可見,對照組的Matrigel內(nèi)血管豐富,而隨著As2O3劑量增加,Matrigel內(nèi)血管逐漸匱乏。Masson染色可見位于毛細血管中的紅細胞,結(jié)果顯示:對照組的血液充盈毛細血管最多,隨著As2O3劑量的增加,血液充盈毛細血管依次減少。用CD31熒光抗體染色以顯示內(nèi)皮細胞,結(jié)果顯示:As2O3處理組的新生血管密度較對照組明顯減少,且管腔結(jié)構(gòu)較對照組明顯異常,管腔呈現(xiàn)扭曲、閉鎖的現(xiàn)象。4、電鏡下觀察肺癌移植瘤組織新生血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu),對照組的血管內(nèi)皮細胞胞膜光滑完整,細胞核結(jié)構(gòu)清晰,而As2O3處理組的內(nèi)皮細胞胞膜發(fā)生皺縮,核仁在核膜下發(fā)生聚集,細胞質(zhì)內(nèi)的空泡樣變增多。5、定量PCR、Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果提示,As2O3處理組移植瘤組織中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1的表達水平均低于對照組。第二部分三氧化二砷對肺癌新生血管生成過程多階段的抑制作用:抑制內(nèi)皮增殖、遷移和管腔形成1、細胞增殖實驗結(jié)果顯示,As2O3處理NSCLC及SCLC細胞,24 h后As2O3處理組與對照組的肺癌細胞增殖情況未見顯著差異;處理48 h后,As2O3處理組的肺癌細胞增殖略低于對照組。而另一方面,As2O3對內(nèi)皮細胞的增殖抑制在24 h時就非常顯著,到48 h抑制增殖更加明顯,4μM As2O3與血管抑制劑索拉非尼對內(nèi)皮細胞的增殖抑制作用相當。2、HUVECs細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,劃痕后24 h可以觀察到As2O3處理組的劃痕修復能力比其他各組減弱。至劃痕后48 h,As2O3處理組的細胞遷移距離顯著低于生理鹽水對照組,As2O3 4μM組比2μM組更加明顯,而索拉非尼組的細胞遷移距離卻與生理鹽水組沒有顯著差異。3、Matrigel體外成管實驗結(jié)果顯示,As2O3能顯著減少HUVECs的細胞連線數(shù)量,并能破壞管腔結(jié)構(gòu)形成,使其連線中斷、不能形成網(wǎng)絡構(gòu)造;索拉非尼也能減少細胞連線數(shù)量,但每個管腔結(jié)構(gòu)依然完整,管腔形態(tài)與對照組相似。4、As2O3呈劑量依賴性下調(diào)肺癌細胞VEGF-A、b FGF、MMP-2、MMP-9和PDGF-BB的蛋白水平,并呈劑量依賴性下調(diào)HUVECs中VEGFR-2、FGFR-1、MMP-2、MMP-9和PDGFR-β的蛋白水平。同時,As2O3能劑量依賴性下調(diào)肺癌細胞中VEGF-A的上游因子HIF-1α的m RNA表達水平。As2O3能在蛋白水平抑制肺癌細胞Dll4與HUVECs細胞Notch-1的表達。第三部分Dll4-Notch介導三氧化二砷抑制內(nèi)皮細胞成管的作用機制研究1、成功構(gòu)建Dll4過表達慢病毒和Notch-1干擾慢病毒,并用其感染HUVECs細胞。結(jié)果顯示Dll4過表達慢病毒感染可上調(diào)HUVECs的Dll4表達,Notch-1干擾慢病毒感染可下調(diào)HUVECs的Notch-1表達。2、Matrigel體外成管實驗結(jié)果顯示:陰性對照慢病毒感染的HUVECs在未加As2O3時能形成交聯(lián)的血管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),添加As2O3時則不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu);過表達Dll4后,未加As2O3時能形成交聯(lián)的血管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),添加As2O3時則不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu),僅能形成個別條索狀結(jié)構(gòu);而抑制Notch-1后,在未添加As2O3時則已經(jīng)不能形成管腔結(jié)構(gòu),添加As2O3時甚至連個別的條索狀結(jié)構(gòu)也不會出現(xiàn)。3、Western blot檢測各組HUVECs細胞Dll4-Notch通路及其下游分子在蛋白水平的表達情況,在陰性對照慢病毒感染的HUVECs細胞中,As2O3對Dll4表達的影響不明顯,但能夠明顯抑制Notch-1及其下游靶基因Hes-1的表達;在Dll4過表達的HUVECs細胞中,As2O3依然能夠下調(diào)Notch-1和Hes-1的表達;在Notch-1 m RNA干擾的HUVECs細胞中,Notch-1和Hes-1表達本身就被下調(diào),As2O3的添加起到疊加作用,使Notch-1和Hes-1的下調(diào)程度更大。4、對我們收集的肺癌臨床標本進行免疫組化檢測,結(jié)果顯示:Dll4、Notch-1、Hes-1和VEGFR-2在肺癌組織中的表達量均高于癌旁組織�！窘Y(jié)論】1、As2O3能通能過抗血管作用從而抑制肺癌移植瘤生長。As2O3不僅可以減少肺癌移植瘤中的新生血管數(shù)量,還能阻礙其管腔結(jié)構(gòu)的形成、破壞肺癌新生血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu),這可能與其下調(diào)VEGF通路及Dll4-Notch通路的作用有關(guān)。2、As2O3能抑制肺癌新生血管生成過程中的多個階段,包括細胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細胞遷移、增殖和管腔形成,并抑制上述各階段所涉及多個促血管因子的表達。3、As2O3通過抑制Notch-1從而阻斷Dll4-Notch信號通路及其下游因子,抑制內(nèi)皮細胞形成血管管腔的能力。4、Dll4-Notch通路相關(guān)因子(包括Dll4、Notch-1和Hes-1等)在患者肺癌組織中高表達,提示該通路可能是As2O3在人體內(nèi)抑制肺癌的作用靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王淑美,徐曉玉,張文亮;調(diào)控血管生成中藥的研究現(xiàn)狀[J];時珍國醫(yī)國藥;2004年09期

2 王國慶,易成,周宏遠;因特網(wǎng)上的血管生成研究資源[J];中國微循環(huán);2004年04期

3 練燕;抑制血管生成:第五類抗癌療法?[J];國外醫(yī)學.護理學分冊;2004年10期

4 金艷,王秀琴;血管生成與抗血管生成策略[J];食品與藥品;2005年09期

5 賈林,袁世珍;腫瘤抗血管治療現(xiàn)狀與血管生成抑制-細胞毒療法[J];廣州醫(yī)學院學報;2000年02期

6 方全;血管生成素與腫瘤新生血管生成[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);2001年05期

7 曹健,郭德玉,張恩娟;血管生成與疾病治療[J];中國藥房;2001年07期

8 王國慶,易成;血管形成新方式——擬血管生成[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);2003年04期

9 鄒戈;腫瘤血管生成與抗血管生成研究進展[J];國外醫(yī)學.泌尿系統(tǒng)分冊;2003年01期

10 張?zhí)祜w,蔣登金,郭光金;血管內(nèi)皮生長因子與血管生成的研究進展[J];局解手術(shù)學雜志;2003年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 馬強;陳剛;徐曉玉;;中藥對血管生成影響研究進展[A];全國第3屆臨床中藥學學術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 林秀坤;;新生血管生成與靶向抗腫瘤海洋藥物的研制策略[A];2007年全國生化與生物技術(shù)藥物學術(shù)年會論文集[C];2007年

3 戰(zhàn)忠利;孫蕾娜;孫慧;賈春實;;肺癌血管生成與血管生成抑制物之間相互關(guān)系的研究[A];第四屆中國腫瘤學術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術(shù)會議論文集[C];2006年

4 戰(zhàn)忠利;;肺癌血管生成與血管生成抑制物之間相互關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2006年學術(shù)年會論文匯編[C];2006年

5 劉麗華;易愛純;;抗血管生成與血管依賴性實體瘤的治療[A];2009年中國藥學大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

6 劉麗華;易愛純;;抗血管生成與血管依賴性實體瘤的治療[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

7 李平;王國慶;;血管靶向及抗血管生成聯(lián)合放射治療的研究進展[A];第一屆中國腫瘤靶向治療技術(shù)大會論文集[C];2003年

8 卞修武;;癌癥和慢性炎癥血管生成的調(diào)控差異及其治療學意義[A];第三屆中國腫瘤學術(shù)大會教育論文集[C];2004年

9 李龍江;溫玉明;王昌美;陳江;;抑制血管生成誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究[A];第一屆全國口腔頜面部腫瘤學術(shù)會議論文匯編[C];2001年

10 沈明秀;王凱;蔡連香;岳開琴;張樹成;李巧風;陳秋梅;;試探中醫(yī)血足則子宮易于容物的內(nèi)涵實驗之一血管生成[A];全國第六屆中西醫(yī)結(jié)合婦產(chǎn)科學術(shù)會議論文及摘要集[C];2002年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 王迪;血管生成藥等待發(fā)力[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

2 丁志山 沃興德;中藥對血管生成影響的研究進展[N];中國醫(yī)藥報;2003年

3 徐蓓;血管生成：從藥用植物到血管的研究 Angiogenesis:From Plants to Blood Vessels[N];中國醫(yī)藥報;2006年

4 白冰　編譯;癌細胞血管生成學說有新變化[N];中國醫(yī)藥報;2008年

5 劉道安;抑制肺癌血管生成“餓死”癌細胞[N];中國醫(yī)藥報;2002年

6 徐峰;腫瘤與血管生成息息相關(guān)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

7 記者劉道安;中藥對肺癌血管生成有抑制作用[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

8 記者 白毅;miRNA在多糖介導的血管生成抑制中起重要作用[N];中國醫(yī)藥報;2014年

9 漁陽;抗血管生成類藥物：有前瞻性的暴利領域[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

10 徐峰;腫瘤與血管生成息息相關(guān)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 王付海;T7肽通過下調(diào)Ang-2表達及聯(lián)合3-MA發(fā)揮其抗血管生成的實驗研究[D];山東大學;2015年

2 向勁松;基于轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的清熱解毒類中藥抗血管生成篩選及對照研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2015年

3 胡峗;miR-29c通過胰島素樣生長因子1抑制人血管內(nèi)皮細胞遷移和血管生成的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

4 高鐘秀子;聲動力治療抑制血管生成和腫瘤生長[D];哈爾濱醫(yī)科大學;2013年

5 杜澄利;MiR-126對肝細胞肝癌的轉(zhuǎn)移和血管生成的作用及機制研究[D];浙江大學;2016年

6 楊勐航;三氧化二砷對肺癌新生血管生成的作用及其機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

7 劉建昆;IL-17在結(jié)直腸癌血管生成中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

8 王心華;力達霉素和大黃素的抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移作用及其機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2001年

9 張彥民;塔斯品堿抑制血管生成的作用及初步機制研究[D];西安交通大學;2008年

10 董豪杰;血管生成素對miR-141的調(diào)控作用及其在血管生成中的功能[D];浙江大學;2014年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 張亮;兩棲類抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽對新生血管生成和黑色素瘤轉(zhuǎn)移侵襲影響的研究[D];遼寧師范大學;2015年

2 劉星星;Lp-PLA_2調(diào)節(jié)VEGF的表達及分子機制[D];吉林大學;2016年

3 任敏;轉(zhuǎn)錄因子SOX2對體外血管生成能力的影響[D];吉林大學;2016年

4 羅曉麗;癌基因DEK調(diào)節(jié)VEGF表達及其在血管生成中作用的初步研究[D];吉林大學;2016年

5 劉亞萍;新霉胺體內(nèi)外抗腫瘤的作用及機制研究[D];華中科技大學;2015年

6 王云情;RA患者外周血細胞亞群上Tim-3、Gal-9表達與炎癥和血管生成的相關(guān)性研究[D];山東大學;2016年

7 裴潔;混料試驗設計對多種生子因子配比優(yōu)化自體顆粒移植脂肪血管生成的研究[D];山西醫(yī)科大學;2014年

8 龐露蘋;嘧啶類衍生物的設計合成及其抑制EMT和血管生成的作用機制研究[D];鄭州大學;2016年

9 李文玉;含硒復合物抑制小鼠移植瘤內(nèi)血管生成誘導抑瘤作用[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

10 顧汝軍;環(huán)磷酰胺抗血管生成化療抑制鼠皮下肉瘤血管生成的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2008年

，

本文編號：2264629