【摘要】：目的:胃癌的死亡率占據(jù)所有腫瘤死亡率的前三位,其高度惡性及術(shù)后各種并發(fā)癥嚴重降低了人類的生存質(zhì)量。微小RNA(MicroRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的與基因調(diào)控有關(guān)的一類小分子非編碼單鏈RNA,參與多種疾病的發(fā)生與進展。本課題是以進展期胃癌原發(fā)灶腫瘤組織(Primary tumor,PT)以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織(Lymph node metastases,LNMs)的新鮮標本以及組織蠟塊為研究對象,采用熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法檢測miRNA-185在PT和LNMs中的表達變化及關(guān)系;RT-PCR技術(shù)和免疫組織化學技術(shù)(Immunohistochemistry SP)檢測PT和LNMs中胃癌細胞多耐藥基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-π(glutathione S-transferase-π,GST-π)、多耐藥相關(guān)蛋白-1(multidrug resistance associated protein-1,MRP-1)和胸苷合成酶(thymidylate synthase,TS)的表達變化;四氮唑藍技術(shù)(MTT)測定常用化療藥物(奧沙利鉑OXA、長春新堿VCR、氟尿嘧啶5-FU、紫杉醇PTX)對胃癌原發(fā)灶癌細胞及相應轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞的抑制情況,探討在胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miRNA-185的表達與腫瘤耐藥性及耐藥基因之間的關(guān)系及意義。方法:收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科2014年10月~2015年10月行手術(shù)切除的胃癌患者胃癌組織、正常胃黏膜組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),共40例患者,淋巴結(jié)均由病理科證實轉(zhuǎn)移。采用RT-PCR的方法檢測胃癌組織、正常胃黏膜組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miRNA-185的表達情況;采用免疫組化方法檢測胃癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中MDR1/P-gp、GST-π、MRP-1和TS的蛋白表達情況;采用MTT方法檢測胃癌化療常用藥物(OXA、VCR、5-FU、PTX)對胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞體外抑制情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理,P㩳0.05時認為差異具有顯著性。結(jié)果:1胃癌原發(fā)灶、正常胃黏膜組織與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miRNA-185的表達在正常胃黏膜組織與胃癌組織的表達程度分別為(0.193±0.154)、(0.084±0.131),t=3.752,P㩳0.001,兩者差異有統(tǒng)計學意義;在正常胃黏膜與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達程度分別為(0.193±0.154)、(0.041±0.050),t=6.605,P0.001,兩者差異有統(tǒng)計學意義;在胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達程度分別為(0.084±0.131)、(0.041±0.050),t=2.129,P㩳0.05,兩者有統(tǒng)計學差異。由此可以看出miRNA-185在正常組織的表達最高,而在胃癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達依次降低。2胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中miRNA-185表達與P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表達及關(guān)系P-gp、MRP-1、GST-π、TS在胃癌原發(fā)灶的陽性表達率分別為58.3%(28/48)、62.5%(30/48)、68.8%(33/48)、64.6%(31/48);在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達率分別為79.2%(38/48)、83.3%(40/48)、75.0%(36/48)、85.4%(41/48)。用Pearsonχ~2檢驗,P-gp、MRP-1、TS在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的的蛋白表達明顯高于原發(fā)灶(分別為χ~2=4.210,P=0.042;χ~2=4.370,P=0.038;χ~2=4.140,P=0.030),GST-π在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的蛋白表達強度高于原發(fā)灶,但無明顯差異(χ~2=0.840,P=0.483)。雙變量相關(guān)分析,P-gp、MRP-1、TS的蛋白表達在胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間呈正相關(guān)(分別為r=0.448,P=0.006,r=0.349,P=0.048,r=0.267,P=0.031),GST-π在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間未見相關(guān)性。在原發(fā)灶中,miRNA-185與P-gp、MRP-1、TS蛋白表達呈負相關(guān)性,分別為(r=0.457,P=0.026)(r=0.367,P=0.005)(r=0.248,P=0.034),在淋巴結(jié)中各變量未見明顯相關(guān)性。3胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞對OXA、5-FU、VCR、PTX體外化療的敏感性比較胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中,VCR對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞的抑制率要明顯低于原發(fā)灶(t=3.264,P㩳0.05),而PTX、5-FU、OXA對腫瘤細胞抑制率在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中無統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)。在原發(fā)灶腫瘤細胞中化療藥物的敏感程度依次為:PTX㧐5-FU㧐VCR㧐OXA;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中化療藥物敏感程度依次為:PTX㧐5-FU㧐OXA㧐VCR。4胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中多耐藥基因P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表達與化療藥物抑制率關(guān)系胃癌原發(fā)灶中,P-gp強表達組5-FU、OXA對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組(t=2.467,P㩳0.05;t=2.149,P㩳0.05);MRP-1強表達組5-FU、PTX、VCR對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組(t=2.553,P㩳0.05;t=2.837,P㩳0.05;t=2.316,P㩳0.05);GST-π強表達組5-FU、PTX對腫瘤細胞的抑制率要明顯低于弱表達組(t=4.627,P㩳0.05;t=3.261,P㩳0.05);TS強表達組5-FU、OXA、PTX對腫瘤細胞的抑制率明顯低于若表達組(t=5.163,P㩳0.05;t=2.479,P㩳0.05;t=3.571,P㩳0.05)。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中,P-gp強表達組PTX、OXA對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組(t=5.541,P㩳0.05;t=3.168,P㩳0.05);MRP-1強表達組5-FU、PTX、VCR對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組(t=2.261,P㩳0.05;t=2.437,P㩳0.05;t=681,P㩳0.05);GST-π強表達組5-FU、OXA對腫瘤細胞的抑制率要明顯低于弱表達組(t=3.529,P㩳0.05;t=3.186,P㩳0.05);TS強表達組5-FU、OXA、VCR對腫瘤細胞的抑制率明顯低于若表達組(t=4.943,P㩳0.05;t=2.267,P㩳0.05;t=3.142,P㩳0.05)。結(jié)論:本研究采用QRT-PCR技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)及MTT法對胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中的miRNA-185表達水平、相關(guān)耐藥蛋白P-gp、MRP-1、GST-π、TS的蛋白表達水平及體外細胞對OXA、5-FU、VCR、PTX藥敏性進行實驗。并分析其相關(guān)性,結(jié)論如下:1 miRNA-185在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達均低于正常胃黏膜組織,而在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達又低于原發(fā)灶。其表達水平的降低可能是導致胃癌發(fā)生的原因,也可能是導致相關(guān)耐藥蛋白升高從而降低腫瘤細胞藥敏性的原因之一。2 通過免疫組化技術(shù)證實P-gp、MRP-1、TS在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達強度要高于胃癌原發(fā)灶,而GST-π在兩者內(nèi)的表達無統(tǒng)計學差異。3 胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中,VCR對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞的抑制率要明顯低于原發(fā)灶(t=3.264,P㩳0.05),而PTX、5-FU、OXA對腫瘤細胞抑制率在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中無統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)。在原發(fā)灶腫瘤細胞中化療藥物的敏感程度依次為:PTX㧐5-FU㧐VCR㧐OXA;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中化療藥物敏感程度依次為:PTX㧐5-FU㧐OXA㧐VCR。4 P-gp、MRP-1、GST-π、TS各自的表達程度僅影響部分化療藥物的耐藥性,胃癌MDR的評價應該從多途徑、多因素進行。綜上所述,miRNA-185在腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達下調(diào)。對相關(guān)耐藥蛋白及細胞藥敏性的研究也可推斷miRNA-185可能是調(diào)控多藥耐藥基因的表達從而使原發(fā)灶癌細胞及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞產(chǎn)生不同的耐藥性。本研究結(jié)果提示miRNA-185有可能成為治療胃癌的新的靶點,但本研究只從其相關(guān)性上進行分析,沒有進行轉(zhuǎn)染比較等更加直觀的科研方法,也沒有進行其相關(guān)耐藥蛋白的m RNA表達水平的檢測,且miRNA-185對MDR的具體調(diào)控機制尚不完全明確,有待進一步行體內(nèi)實驗及分子間作用機制的研究。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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本文編號：2258790