【摘要】：背景和目的在全球范圍內(nèi),肺癌是發(fā)病率和死亡率均居于首位的惡性腫瘤,每年有160萬患者被診斷為肺癌,同時有140余萬的患者被肺癌奪取生命,其中80%的肺癌為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。目前治療NSCLC的常規(guī)方法有手術(shù)治療、鉑二聯(lián)化療、放療和靶向治療等,但是這些常規(guī)治療方法對中晚期腫瘤患者來說不能達到治愈的目的,因此,多數(shù)患者治療后生存期仍很短,5年生存率不到15%。由于多數(shù)NSCLC患者早期無特異臨床表現(xiàn),在確診時已至中晚期,多數(shù)患者已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和局部侵犯。因此,探討NSCLC的發(fā)病調(diào)控機制,早期干預(yù)腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移能力,有助于提高NSCLC病人的生存率,降低其死亡率。長鏈非編碼RNA(long non-codingRNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200核苷酸,不能編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。LncRNA參與了生命進程中一系列的重要進程,包括生長發(fā)育、骨髓造血、細胞凋亡、細胞增殖等。但是人類對lncRNA在腫瘤中的調(diào)控機制卻了解很少。已有的研究資料顯示許多l(xiāng)ncRNA在不同腫瘤組織中的表達發(fā)生了改變。因此,其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用備受關(guān)注。雖然大多數(shù)lncRNA的詳細作用機制尚不明確,但lncRNA已成為繼mi RNA之后的新的腫瘤研究熱點。LncRNA DLX6-AS1定位于7q21.3,查閱國內(nèi)外文獻目前未見其他研究者關(guān)于lncRNA DLX6-AS1在肺癌中的報道。為了探索lncRNA DLX6-AS1在肺腺癌細胞的表達、生物學(xué)作用及其對腫瘤的調(diào)控的初步機制,本課題進行了三個部分的研究。第一部分:肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA表達分析;第二部分:下調(diào)肺腺癌細胞中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1的表達對細胞增殖、凋亡和侵襲的影響;第三部分:lncRNA DLX6-AS1作用機理的初步分析。第一部分肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA表達分析方法:1.收集標本,包括72例肺腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織標本。2.采用lncRNA芯片檢測3例肺腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織標本中l(wèi)ncRNA表達情況,分析差異化表達的lncRNA。3.運用q RT-PCR檢測72例樣本中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達水平,分析其表達水平與肺腺癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期的相關(guān)性。結(jié)果:1.LncRNA芯片檢測分析篩選出18個lncRNAs在肺腺癌組織中表達異常,其中9個lncRNAs表達上調(diào),9個lncRNAs表達下調(diào)。LncRNA DLX6-AS1在肺腺癌組織中呈高表達(P0.05)。2.q RT-PCR檢測顯示在肺腺癌組織,lncRNA DLX6-AS1表達水平較正常組織顯著升高(P0.05),lncRNA基因芯片結(jié)果和q RT-PCR的結(jié)果保持一致,這也說明了基因芯片結(jié)果的可靠性。3.肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1的表達水平與患者的腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(P0.05),而與其性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P0.05)。第二部分下調(diào)肺腺癌細胞中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1的表達對細胞增殖、凋亡和侵襲的影響方法:1.制備和包裝沉默lncRNA DLX6-AS1表達的重組慢病毒,感染對數(shù)期生長的肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1650,建立下調(diào)lncRNA DLX6-AS1表達的肺腺癌細胞株。2.設(shè)立三組:實驗組(lncRNA DLX6-AS1si RNA慢病毒感染組)、NC組(lncRNA-NC無關(guān)序列對照組)和Blank組(空白細胞)。3.CCK-8法、平板克隆形成實驗檢測三組細胞增殖和生長能力。4.Anncxin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)、Hoechst染色、Caspase-3/7活性檢測檢測三組細胞凋亡率。5.Western-blot檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。6.Transwell小室實驗、劃痕實驗檢測三組細胞侵襲遷移能力。7.荷瘤小鼠實驗檢測體內(nèi)水平沉默lncRNA DLX6-AS1的表達對肺腺癌影響。結(jié)果:1.成功制備了重組慢病毒lncRNA DLX6-AS1si RNA和無關(guān)序列對照lncRNA DLX6-AS1 NC,慢病毒滴度分別為1.8×108TU/ml和2.3×108TU/ml。對比空白組和無關(guān)序列對照組,si Lnc DLX6-AS1組lncRNA DLX6-AS1表達水平顯著下調(diào)(P0.05)。2.CCK8法檢測結(jié)果顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞較空白組和無關(guān)序列對照組吸光度顯著減少,且隨著時間的持續(xù),差異越來越大,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞較空白組和無關(guān)序列對照組細胞克隆形成數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.Anncxin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)和Hoechst染色檢測顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞凋亡率較空白組和無關(guān)序列對照組顯著升高,對比空白組和無關(guān)序列對照組,si Lnc DLX6-AS1組Caspase-3/7細胞活性顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.Western blot結(jié)果顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞與空白組和無關(guān)序列對照組細胞相比,Cleaved caspase3和Cleaved caspase9蛋白表達水平呈升高狀態(tài),而Pro-capase-9與Bcl-2的蛋白表達水平呈明顯降低狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.Transwell小室實驗結(jié)果顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞與空白組和無關(guān)序列對照組細胞相比,穿膜細胞數(shù)顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。劃痕實驗顯示在A549和H1650細胞中,si Lnc DLX6-AS1組細胞與空白組和無關(guān)序列對照組細胞相比,劃痕愈合速度明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.裸鼠移植瘤體內(nèi)實驗結(jié)果顯示對比空白組和無關(guān)序列對照組,si Lnc DLX6-AS1組移植瘤顯著減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第三部分lncRNA DLX6-AS1作用機理的初步分析方法:1.通過生物信息學(xué)分析推測lncRNA DLX6-AS1潛在相互作用的mi RNA。2.構(gòu)建lncRNA DLX6-AS1野生型和Seed Region突變型表達載體(pc DNA3.1-Wt DLX6 AS1、pc DNA3.1-Mt DLX6 AS1),并轉(zhuǎn)染A549細胞。q RT PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細胞中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1和mi R-497的表達。3.構(gòu)建報告基因重組載體pmir GLO-Wt3’UTR-Bcl2和pmir GLO-Mt3’UTR-Bcl2。采用雙熒光素酶報告實驗驗證Bcl-2是mi R-497的靶基因及l(fā)ncRNA DLX6-AS1通過負調(diào)控mi R-497調(diào)控Bcl-2的表達。4.CCK-8法、Anncxin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)、Transwell小室實驗檢測上調(diào)mi R-497和下調(diào)lncRNA DLX6-AS1的表達對肺腺癌細胞的作用。5.構(gòu)建無3’UTR區(qū)Bcl-2的表達載體,單獨轉(zhuǎn)入或與mi R-497 mimics共轉(zhuǎn)染入A549細胞或si Lnc DLX6-AS1轉(zhuǎn)染的A549細胞中,通過restore方法分析mi R-429調(diào)控Bcl-2表達的作用機制。結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析推測ln RNA DLX6-AS1和mi R-497存在潛在的相互作用的seed region區(qū)有特異結(jié)合位點。2.LncRNA DLX6-AS1的對A549細胞株中mi R-497的表達起負調(diào)控作用,該負調(diào)控作用是通過seed region區(qū)特異結(jié)合而實現(xiàn)的。3.雙熒光素酶報告實驗顯示Bcl-2是mi R-497一個靶基因。4.在A549細胞中過表達mi R-497和沉默lncRNA DLX6-AS1的表達可以起到相似的生物學(xué)效應(yīng)。5.血清饑餓誘導(dǎo)凋亡實驗結(jié)果顯示將不含Bcl-2 3’UTR區(qū)的重組載體pc DNA3.1-Bcl2轉(zhuǎn)染至A549細胞后,可以回復(fù)上調(diào)mi R-497和下調(diào)lncRNA DLX6-AS1促進細胞凋亡的能力。結(jié)論:1.芯片篩選出18個lncRNAs在肺腺癌組織中表達異常,其中9個lncRNAs表達上調(diào),9個lncRNAs表達下調(diào)。LncRNA DLX6-AS1在肺腺癌組織中呈高表達,其表達水平與患者的腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)。2.體外下調(diào)肺腺癌細胞中的lncRNA DLX6-AS1表達可有效抑制細胞的增殖、降低細胞侵襲遷移能力,并且促進細胞的凋亡。動物實驗表明下調(diào)lncRNA DLX6-AS1的表達能有效抑制裸鼠移植瘤生長。3.LncRNA DLX6-AS1通過負調(diào)控mi R-497調(diào)控Bcl-2的表達,從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。4.LncRNA DLX6-AS1發(fā)揮促癌作用,有望成為肺腺癌治療新的靶點。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2256774