【摘要】：目的:微小RANs(microRNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著十分重要的角色,已經(jīng)被公認(rèn)是一種具有潛在價(jià)值的非侵襲性生物標(biāo)志物。研究表明,microRNAs的含量在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。因此,對(duì)microRNAs的早期、快速、靈敏和特異地檢測(cè),成為臨床和科研工作者亟需解決的難題。本研究利用DNA納米技術(shù)和碳納米粒子制備電化學(xué)生物傳感器對(duì)microRNAs進(jìn)行檢測(cè),旨在為臨床醫(yī)生對(duì)腫瘤的早期篩查和診斷提供重要依據(jù)。方法:1.電化學(xué)生物傳感器的制備:基于等溫目標(biāo)循環(huán)放大和DNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)觸發(fā)反應(yīng)構(gòu)建高靈敏的通用電化學(xué)生物傳感器;基于點(diǎn)擊化學(xué)介導(dǎo)的酶輔助目標(biāo)循環(huán)(EATR)和多功能化碳納米粒子(MFC60)雙放大策略構(gòu)建超靈敏的電化學(xué)生物傳感器。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、透射電子顯微鏡(TEM)、X射線光電子能譜(XPS)和電化學(xué)技術(shù)等方法對(duì)傳感器的每一步修飾和納米材料的合成進(jìn)行驗(yàn)證和表征。2.MFC60的合成:用溶劑交換法制備富勒烯(C60)的水溶液;利用超分子化學(xué)合成同時(shí)具有氨基(-NH2)和巰基(-SH)修飾的MFC60。3.電化學(xué)生物傳感器的可行性驗(yàn)證及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:用電化學(xué)方法驗(yàn)證傳感器的可行性;優(yōu)化捕獲探針的序列、捕獲探針的固定時(shí)間、核酸鏈的反應(yīng)比例、疊氮鏈和炔氫鏈的序列等實(shí)驗(yàn)條件。4.傳感器分析性能的評(píng)價(jià)及樣本的檢測(cè):合理評(píng)價(jià)兩種傳感器的分析性能,如線性范圍、最低檢測(cè)限、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等;將待測(cè)樣本中目標(biāo)物的信號(hào)轉(zhuǎn)化為可以檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行分析。結(jié)果:1.用多種方法對(duì)制備的兩種電化學(xué)生物傳感器和碳納米材料進(jìn)行表征和驗(yàn)證,結(jié)果表明傳感器的制備和材料的合成均是成功的。2.基于等溫目標(biāo)循環(huán)放大和DNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)觸發(fā)反應(yīng)構(gòu)建的通用電化學(xué)生物傳感器,其各項(xiàng)性能:可高靈敏地檢測(cè)micro RNA-21;檢測(cè)線性范圍為0.5-2000 p M;最低檢測(cè)限為56 f M;特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。3.基于點(diǎn)擊化學(xué)介導(dǎo)的EATR和MFC60雙重放大策略構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器,其各項(xiàng)性能:通過雙重放大策略,本方法能超靈敏地檢測(cè)micro RNA-141;檢測(cè)的線性范圍為0.1 p M到100 n M;最低檢測(cè)限為7.78 f M;擁有良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)論:本研究分別應(yīng)用等溫目標(biāo)循環(huán)反應(yīng)耦合DNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和點(diǎn)擊化學(xué)介導(dǎo)的酶輔助目標(biāo)循環(huán)結(jié)合多功能化碳納米粒子構(gòu)建用于microRNAs檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器。兩種傳感器分別應(yīng)用于mi RNA-21的檢測(cè)和mi RNA-141的檢測(cè)。在不同的信號(hào)放大技術(shù)下,均展現(xiàn)出對(duì)microRNAs的高靈敏分析性能。同時(shí),運(yùn)用多種技術(shù)對(duì)合成的納米材料和制備的傳感器進(jìn)行表征,結(jié)果表明納米材料的成功合成和傳感器的成功制備。值得注意的是,兩種傳感器平臺(tái)都可以通過改變捕獲探針的相應(yīng)序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)其它核酸的檢測(cè);基于點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建的傳感器還可以用于對(duì)銅離子濃度的檢測(cè)。因此,本研究制備的電化學(xué)生物傳感器因其良好的分析性能,在核酸分析領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Multi-class cancer classification through gene expression profiles: microRNA versus mRNA[J];遺傳學(xué)報(bào);2009年07期

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本文編號(hào)：2256544