【摘要】：慢性粒細胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是獲得性造血干細胞惡性克隆性疾病,為我國最常見的一種慢性白血病,約占成人白血病的15%~20%。臨床分期包括慢性期(Chronic Phase,CP)、加速期(Accelerated Phase,AP)和急變期(Blastic Phase,BP)。加速期和急變期被認為是疾病進展期。t(9;22)(q34;q11)易位形成Ph染色體并導(dǎo)致BCR/ABL融合基因的形成,其編碼的P210BCR/ABL蛋白具有極強的酪氨酸激酶活性,使一系列信號蛋白發(fā)生持續(xù)磷酸化,影響細胞的增殖、分化及凋亡,是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)。盡管10余年來酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)極大改善了CML患者的預(yù)后。但隨著臨床應(yīng)用范圍的擴大和時間的推移,一些患者出現(xiàn)耐藥及疾病進展,治療效果差,死亡率極高。為克服這一難題,人們積極尋找新的治療靶標(biāo)及聯(lián)合應(yīng)用其他藥物。腫瘤發(fā)生與原癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。抑癌基因失活受遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的調(diào)控。表觀遺傳學(xué)(epigenetic)指DNA序列不發(fā)生變化而基因表達發(fā)生可遺傳的改變,并在細胞發(fā)育和增殖過程中能夠穩(wěn)定傳遞,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑及RNA干擾等。抑癌基因PTPN6(又名SHP-1)屬胞漿蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)家族,在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起負調(diào)控作用,與腫瘤的形成及生長負相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)PTPN6基因啟動子甲基化導(dǎo)致其在CML患者中低表達。抑癌基因的甲基化和組蛋白修飾,是腫瘤細胞最常見的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。啟動子甲基化可直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合,抑制基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histone acetyhransferase,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)共同調(diào)控組蛋白的乙�；揎�。HDACs通過減低組蛋白乙酰化水平,使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊縮,阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄,影響細胞分化、凋亡。本課題旨在通過對PTPN6基因與CML進展的關(guān)系、以及甲基化和組蛋白去乙�；瘜TPN6的調(diào)控作用及機制的研究,為攻克CML進展提供新思路。本研究論文分為三部分:第一部分:慢性粒細胞白血病患者PTPN6基因異常甲基化調(diào)控機制的研究目的:檢測CML患者中PTPN6基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),及PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA和蛋白水平表達情況,探討PTPN6基因與CML進展的關(guān)系及甲基化和組蛋白去乙�；瘜ζ涞恼{(diào)控作用。方法:44例2014年9月~2016年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科和兒科就診的CML患者按疾病分期分為三組,10例健康志愿者或營養(yǎng)性貧血患者為對照組(Normal Control,NC)。收集骨髓液或外周血后,提取單個核細胞。MSP法檢測PTPN6基因啟動子區(qū)Cp G島的甲基化狀態(tài),PCR和Western Blot檢測PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白的表達。結(jié)果:1 CML患者PTPN6基因啟動子甲基化情況NC組未檢測到甲基化。20例CML-CP患者中5例檢測到甲基化,陽性率為25%;24例CML進展期患者(包括14例CML-AP和10例CML-BP)均檢測到甲基化。CML進展期患者啟動子甲基化陽性率較NC組及CML-CP組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01;NC組與CML-CP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P=0.14。2 CML患者各基因m RNA水平的表達情況DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA在CML各期患者的表達量高于NC組,PTPN6 m RNA表達量低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;DNMT3b m RNA較NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。其中,DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表達量在CML-BP組最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。PTPN6 m RNA表達量在CML-CP組最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,CML-AP與CML-BP組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3 CML患者各基因蛋白水平的表達情況DNMT1蛋白在NC組低表達,在CML患者組高表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),各期患者間的表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1蛋白在NC組低表達,在CML患者組高表達,CML-BP組最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。PTPN6蛋白在NC組高表達,在CML患者組低表達,CML-BP組表達量最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3b蛋白水平在NC組和CML患者組中無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。結(jié)論:CML進展期患者PTPN6基因低表達,與其啟動子區(qū)高甲基化有關(guān),可能受DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1基因的調(diào)控。第二部分:去甲基化藥物和組蛋白去乙酰化酶抑制劑對K562細胞、KCL22細胞中PTPN6基因的作用及機制目的:去甲基化藥物和組蛋白去乙�；敢种苿┓謩e處理K562和KCL22細胞后,檢測PTPN6基因甲基化變化,PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白水平表達量變化,探討甲基化和組蛋白修飾對CML急變細胞系中PTPN6基因調(diào)控作用機制。方法:不同濃度去甲基化藥物(Decitabine和5-Azacytidine)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑[(valproic acid,VPA)和LBH589]處理KCL22細胞和K562細胞后,亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)檢測PTPN6基因啟動子區(qū)Cp G島的甲基化變化,PCR和Western Blot檢測PTPN6、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Me CP2、MBD2和HDAC1基因m RNA及蛋白表達及變化情況。結(jié)果:1 BSP法檢測PTPN6基因啟動子甲基化情況在K562細胞中,藥物處理前PTPN6基因啟動子甲基化Cp G為80.9%。VPA處理后為56.4%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。LBH589處理后為80.9%,5-Azacytidine為78.2%,Decitabine為81.8%。這三組與處理前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,藥物處理前PTPN6基因啟動子甲基化Cp G為85.5%。VPA處理后為66.4%,Decitabine處理后為72.7%,這兩組均較處理前差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。LBH589處理后為82.7%,5-Azacytidine為77.3%,這兩組與處理前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2藥物處理細胞后各基因m RNA的表達變化1)VPA處理細胞后m RNA的表達變化在K562細胞中,藥物處理后,DNMT1、Me CP2和MBD2 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT3a和HDAC1 m RNA明顯下降,低濃度組與中、高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,中濃度和高濃度組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,藥物處理后,DNMT1、DNMT3a和HDAC1 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。MBD2 m RNA表達量下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但各濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3b和Me CP2 m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2)LBH589處理細胞后m RNA的變化情況在K562細胞中,藥物處理后,DNMT3a、Me CP2和HDAC1 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT1和MBD2 m RNA表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但各濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,藥物處理后,DNMT1和MBD2 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。HDAC1 m RNA表達量下降(P0.05),但各濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3a、DNMT3b和Me CP2 m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3)5-Azacytidine處理細胞后m RNA的變化情況在K562細胞中,藥物處理后,Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT1和DNMT3a m RNA表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但各濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,藥物處理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4)Decitabine處理細胞后m RNA的變化情況在K562細胞中,藥物處理后,DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT1 m RNA表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但各濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,藥物處理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1 m RNA表達量明顯下降,PTPN6 m RNA表達量明顯升高,高濃度組最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。DNMT3b m RNA表達量在藥物處理前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3藥物處理細胞后各基因蛋白水平的表達情況在K562和KCL22細胞中,藥物處理后,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1蛋白表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),PTPN6蛋白表達量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),DNMT3b蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在K562細胞中,VPA和5-Azacytidine處理后,DNMT3a和MBD2蛋白表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但這兩藥物間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5-Azacytidine處理后,Me CP2蛋白下降最明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。VPA處理后,PTPN6蛋白增加量最少,其他三組均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但這三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在KCL22細胞中,5-Azacytidine和Decitabine處理后,Me CP2和MBD2蛋白表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但這兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5-Azacytidine處理后,DNMT3a和HDAC1蛋白表達量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。LBH589和Decitabine處理后,PTPN6蛋白表達量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但這兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1在CML急變細胞株KCL22和K562中,PTPN6基因啟動子高甲基化,表達量低,可能與DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1基因有關(guān)。2應(yīng)用去甲基化藥物和組蛋白去乙酰化酶抑制劑后,PTPN6基因甲基化程度降低,表達量增加,DNMT1、DNMT3a、Me CP2、MBD2和HDAC1的表達量也降低。3去甲基化藥物有組蛋白去乙酰化酶抑制劑作用,組蛋白去乙�；敢种苿┮灿腥ゼ谆饔�。5-Azacytidine顯示出較強的組蛋白去乙�；敢种苿┳饔�,VPA顯示出較強的去甲基化作用。第三部分:HDAC1對PTPN6基因調(diào)控機制的研究目的:探討HDAC1對PTPN6基因的調(diào)控機制。方法:在KCL22細胞中,以小鼠Ig G抗體作為對照抗體,CoIP-MS檢測與PTPN6蛋白結(jié)合的蛋白并質(zhì)譜分析。ChIP-seq檢測與HDAC1蛋白結(jié)合的基因并測序分析。結(jié)果:1 CoIP-MS結(jié)果:PTPN6抗體IP下來的樣品鑒定到561個蛋白,對照抗體IP下來的樣品鑒定到393個蛋白,其中有300個蛋白在PTPN6抗體IP組被單獨檢測出,即有300個蛋白與PTPN6蛋白相互作用。這300個蛋白中,經(jīng)質(zhì)譜分析確定HDAC1蛋白與PTPN6蛋白直接結(jié)合。軟件分析可知富集到的蛋白主要參與細胞存活與死亡、蛋白質(zhì)的合成、細胞生長和增殖、細胞功能與維護等生物過程,并與EIF2信號通路、蛋白泛素化途徑及細胞周期信號通路密切相關(guān),受CD437、RICTOR、MYC等上游因子調(diào)控,與腫瘤、組織損傷、遺傳性疾病有關(guān),惡性血液病密切相關(guān)。2 ChIP-seq結(jié)果:進行ChIP-seq測序后,平均產(chǎn)出27588525條原始reads,通過質(zhì)控的Clean Reads為26510483,在全基因組范圍進行Peak(ChIP Sequencing富集區(qū)域)掃描,得到2985個基因,包括MAPK、AKT、STAT5基因。對基因功能元件分析顯示,內(nèi)含子占36.7%,外顯子占4.1%,上游調(diào)控元件占4.9%,下游調(diào)控元件占2%。對富集到的基因進行通路分析顯示,與MAPK/ERK、PI3K/Akt/NF-κB、JAK/STAT、c-myc信號通路密切相關(guān)。結(jié)論:在CML急變細胞株KCL22中,MAPK、AKT、STAT5基因?qū)DAC1蛋白可能存在調(diào)控作用,HDAC1蛋白對PTPN6蛋白可能存在調(diào)控作用,具體機制正在進一步研究。總之,PTPN6基因與CML進展密切相關(guān)。在進展期CML中,PTPN6基因啟動子區(qū)高甲基化,導(dǎo)致其表達受抑制。甲基化和組蛋白去乙酰化均參與了對PTPN6異常甲基化的調(diào)控。可能的機制是:MAPK、AKT、STAT5基因促進HDAC1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成,通過Me CP2和MBD2的橋梁作用,使DNMT1、DNMT3a發(fā)揮作用,從而導(dǎo)致PTPN6基因甲基化。組蛋白去乙酰化酶抑制劑有望應(yīng)用于克服CML進展的治療中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.72

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本文編號：2256040