【摘要】：卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)是一種跨膜糖蛋白,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。在成年人和動(dòng)物中,FSHR僅在睪丸支持細(xì)胞(testicular sertoli cells)和卵巢粒層細(xì)胞(ovarian granulosa cells)表面表達(dá),在睪丸和卵巢血管內(nèi)皮細(xì)胞低表達(dá)。促性腺激素卵泡刺激素(FSH)通過(guò)與睪丸支持細(xì)胞和卵巢粒層細(xì)胞表面的FSHR結(jié)合,在性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)FSHR可能在腫瘤血管形成中發(fā)揮作用。本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)作為血管形成模型,分析FSH對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及成管作用的影響。另外,采用本研究組前期獲的一株抗FSHR納米抗體VHHFSHR-06與FSH拮抗劑蘇拉明,研究阻斷FSH-FSHR的結(jié)合對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移及成管作用的影響,為明確FSHR的作用和今后開展基于FSHR的抗血管治療提供新的靶點(diǎn)。本研究包括兩個(gè)方面:1、FSHR在腫瘤血管形成中的作用初探利用體外血管形成模型HUVEC細(xì)胞探討FSH-FSHR在血管形成中的作用。采用RT-PCR、western blotting、細(xì)胞免疫化學(xué)和成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞中FSHR的表達(dá),結(jié)果表明,FSHR在HUVEC和卵巢腺癌細(xì)胞(Caov-3)均有表達(dá),而在卵巢癌細(xì)胞(Skov-3)中不表達(dá)。為了更進(jìn)一步分析FSHR在血管形成中的作用,以FSH(600 ng/m L)刺激HUVEC細(xì)胞,隨后分別加入差異濃度的FSH阻斷劑蘇拉明[100,1000μg/mL],檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及成管的影響。結(jié)果表明,FSH(600 ng/mL)作用于HUVEC細(xì)胞明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移,而不同濃度的蘇拉明對(duì)由FSH刺激的遷移有抑制作用,呈劑量依賴性。FSH(600ng/mL)還能促成HUVEC細(xì)胞的增殖(P0.01),而蘇拉明能夠抑制這種FSH引起的細(xì)胞增殖,100μg/mL的蘇拉明對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用(P0.01),1000μg/mL蘇拉明對(duì)細(xì)胞的抑制作用極顯著(P0.001)。此外,蘇拉明還能抑制由FSH刺激引起的HUVEC細(xì)胞成管現(xiàn)象。綜上可以說(shuō)明,FSH能夠促進(jìn)表達(dá)FSHR的HUVEC細(xì)胞的遷移、增殖及成管作用,蘇拉明對(duì)FSHR陽(yáng)性的HUVEC和Caov-3細(xì)胞的遷移和增殖具有一定抑制作用,但對(duì)FSHR陰性的CT-26細(xì)胞沒有作用。初步提示FSH可能通過(guò)作用于其受體FSHR發(fā)揮以上作用。2、抗FSHR納米抗體VHH-06親和力成熟采用兩種方法對(duì)前期從天然駱駝非免疫文庫(kù)中篩選得到的抗FSHR納米抗VHHFSHR-06的親和力進(jìn)行改進(jìn),以更好的利用該抗體開展FSH-FSHR的阻斷實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)其抗血管形成效應(yīng)。(1)采用定點(diǎn)飽和突變方式在VHH-06核酸CDR3序列處,進(jìn)行除終止密碼子外的氨基酸隨機(jī)突變,形成由15個(gè)長(zhǎng)度隨機(jī)突變氨基酸組成的CDR3突變文庫(kù),連接到噬菌體載體pMECS中,電轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞,獲得庫(kù)容大小為7.36×108的突變文庫(kù)(NNY)NL-06/ΔCDR3。采用FSHR234蛋白對(duì)VHH06突變庫(kù)(NNY)NL-06/ΔCDR3進(jìn)行6輪的反復(fù)親和篩選,從輸出噬菌體數(shù)量來(lái)看,克隆得到了富集。采用多克隆phage ELISA測(cè)定也表明,從第四輪開始,抗原特異的噬菌體得到了積累,但在隨后對(duì)第六輪的100個(gè)克隆進(jìn)行的單克隆phage ELISA檢測(cè)中沒有得到具有明顯結(jié)合的克隆。原因可能是該突變文庫(kù)的功能性多樣性不足,文庫(kù)質(zhì)量存在問題。(2)將VHH-06與COMP48偶聯(lián)來(lái)嘗試提高納米抗體與FSHR結(jié)合的能力。COMP48是源自人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein)的一段具有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的48肽。VHH-06羧基端與COMP48偶聯(lián),轉(zhuǎn)化至BL21進(jìn)行了表達(dá)和純化,得到非還原條件下110 kD,還原條件下25kD大小的目的蛋白,但在隨后的ELISA檢測(cè)中,并沒有顯著提高與FSHR結(jié)合能力。本研究通過(guò)兩種策略以期達(dá)到提高納米抗體親和力的效果,但并未取得預(yù)期目的�？赡芤�?yàn)榈鞍椎牟徽_折疊或者是人工構(gòu)建的突變庫(kù)中有功能的序列太少等原因。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FSH可能通過(guò)作用于其受體FSHR對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、成管、遷移發(fā)揮作用。為FSHR作為新的抗腫瘤靶點(diǎn)提供支持,為抗血管形成治療提供新思路、新依據(jù)。
[Abstract]:The follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) is a transmembrane glycoprotein that is a member of the G protein-coupled receptor family. In adults and animals, FSHR is expressed only on the surface of testicular Sertoli cells and ovarian granulosa cells, and in the endothelial cells of testis and ovary. In this study, human Umbilical Vein Endothelial Cells (HU) were used to study the role of gonadotrophin follicle stimulating hormone (FSH) in gonadal development. VEC) was used as a model of angiogenesis to analyze the effects of FSH on proliferation, migration and tubulation of HUVEC cells. In addition, the effects of blocking the binding of FSH-FSHR on proliferation, migration and tubulation of HUVEC cells were studied by using VHHFSHR-06, an anti-FSHR nano-antibody, and suramin, an antagonist of FSH. This study included two aspects: 1. The role of FSHR in tumor angiogenesis was explored by using in vitro angiogenesis model HUVEC cells to explore the role of FSH-FSHR in angiogenesis. The FSHR in HUVEC cells was detected by RT-PCR, Western blotting, cytoimmunochemistry and vascular test. The results showed that FSHR was expressed in both HUVEC and ovarian adenocarcinoma cells (Caov-3), but not in ovarian cancer cells (Skov-3). The results showed that FSH (600 ng/mL) significantly promoted the migration of HUVEC cells, while different concentrations of sulamine inhibited the migration stimulated by FSH in a dose-dependent manner. FSH (600 ng/mL) also promoted the proliferation of HUVEC cells (P 0.01), and sulamine inhibited the proliferation of HUVEC cells induced by FSH. In addition, suramin inhibited the tube formation of HUVEC cells stimulated by FSH. In conclusion, FSH could promote the migration, proliferation and tubulation of HUVEC cells expressing FSHR. Lamine inhibited the migration and proliferation of FSHR-positive HUVEC and Caov-3 cells, but had no effect on FSHR-negative CT-26 cells. It was preliminarily suggested that FSH might play the above role by acting on its receptor FSHR. 2. The affinity maturation of anti-FSHR nano-antibody VHH-06 from natural camel non-immune library was achieved by two methods. The affinity of the selected anti-FSHR nano-anti-VHHFSHR-06 was improved in order to make better use of the antibody to carry out the blocking test of FSH-FSHR and evaluate its anti-angiogenesis effect. (1) Site-directed saturation mutation was used to carry out random amino acid mutation at the CDR3 sequence of VHH-06 nucleic acid except termination codon, resulting in 15 random processes of length. CDR3 mutant library consisting of mutant amino acids was linked to the phage vector pMECS, and transformed into TG1 competent cells by electroporation. The mutant library (NNNY) NL-06/CDR3 with a capacity of 7.36*108 was obtained. The VH06 mutant library (NNNNY) NL-06/CDR3 was screened by using FSHR234 protein for six rounds of repeated affinity screening. Polyclonal phage ELISA assay also showed that antigen-specific phages were accumulated from the fourth round, but no clones were found to bind to each other in the subsequent phage ELISA assay of 100 clones from the sixth round. The reason may be due to the lack of functional diversity of the mutant library and the quality of the library. (2) Coupling VHH-06 with COMP48 is an attempt to improve the binding ability of nano-antibodies to FSHR. COMP48 is a 48-peptide with helical convolution structure derived from human cartilage oligomeric matrix protein. The carboxyl end of VHH-06 is coupled with COMP48 and transformed into BL21 for expression and purification under non-reduced conditions, 110. KD, the target protein of 25 kD size under reduction condition, did not significantly improve the binding ability to FSHR in subsequent ELISA detection. Two strategies were used to improve the affinity of antibodies, but the expected results were not achieved. These results suggest that FSH may play an important role in the proliferation, tube formation and migration of HUVEC cells by acting on its receptor FSHR.
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2249933