【摘要】：槐耳是一種藥用真菌,1600多年前即開(kāi)始在中國(guó)用于抗癌治療,其菌質(zhì)發(fā)酵后的熱水提取物為槐耳清膏。槐耳具有抗腫瘤活性,可以抑制血管及腫瘤形成、抗腫瘤耐藥、抑制癌轉(zhuǎn)移、激活免疫系統(tǒng)以及誘導(dǎo)凋亡等�；倍饕ㄟ^(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗肝癌的作用,但具體通過(guò)什么凋亡途徑、作用的具體靶點(diǎn)、凋亡調(diào)控機(jī)制等尚未得到深入研究。近些年自噬研究成為熱點(diǎn)。自噬(Autophagy)是一種進(jìn)化非常保守的生理過(guò)程,在應(yīng)激、饑餓、缺氧以及生長(zhǎng)因子缺乏條件下,細(xì)胞降解其自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器而產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子以及能量來(lái)支持細(xì)胞的生存以及活性,是一種實(shí)行 自我消化‖的一系列生化過(guò)程。在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中,自噬可以起到促進(jìn)和抑制的雙重作用。凋亡與自噬之間存在相互聯(lián)系,自噬可以抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞生存、增殖,但自噬本身也會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡或誘發(fā)細(xì)胞死亡,在與凋亡協(xié)同作用下或在凋亡缺陷的情況下獨(dú)自誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。目前在槐耳抑制肝癌細(xì)胞機(jī)制研究中,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)自噬的報(bào)道,自噬起到什么作用、其與凋亡的關(guān)系仍然不明,值得我們進(jìn)行探究。腫瘤的形成與發(fā)展與信號(hào)通路密切相關(guān)。在與肝癌相關(guān)的信號(hào)通路中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal-regulated protein kinases,ERK),C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK),和p38激酶(p38MAPK)。MAPK可以通過(guò)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)家族蛋白調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),從而參與幾乎所有的細(xì)胞病理、生理過(guò)程,包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞存活與死亡、基因表達(dá)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。而mapk信號(hào)通路也可以通過(guò)bcl-2家族蛋白參與對(duì)自噬的調(diào)控,p38mapk可以對(duì)自噬發(fā)揮促進(jìn)和抑制雙重作用;jnk與erk則能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬。因而在本實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)mapk信號(hào)通路在槐耳抑制肝癌細(xì)胞過(guò)程中所起到的作用進(jìn)行了較為深入的研究。bcl-2家族蛋白是機(jī)體清理異常細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激下,抗凋亡和促凋亡的bcl-2家族蛋白之間的平衡以及相互作用影響下游促凋亡蛋白bax和bak的激活。在激活狀態(tài)下,bak和bax的構(gòu)象發(fā)生改變并穿透線粒體外膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前除了已經(jīng)明確bcl-2可以阻抑線粒體外膜的滲透性,阻止細(xì)胞色素c和其他能夠激活蛋白酶和caspase的促凋亡蛋白的釋放外,bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體凋亡的機(jī)制仍未完全研究清楚。本研究采用流式細(xì)胞分析、mtt、凋亡及自噬相關(guān)抑制劑應(yīng)用、免疫熒光、westernblot等方法,觀察肝癌細(xì)胞hepg2及huh7在槐耳處理后的增殖和凋亡的變化;檢測(cè)槐耳對(duì)凋亡相關(guān)蛋白包括caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及mapk信號(hào)通路蛋白、akt/mtor信號(hào)通路蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;采用凋亡抑制劑、自噬誘導(dǎo)或抑制劑后觀察肝癌細(xì)胞增殖及凋亡變化,同時(shí)檢測(cè)caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá),研究槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響,探討其誘導(dǎo)、調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡及自噬的相關(guān)機(jī)制,為槐耳治療肝癌提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分槐耳抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡目的:觀察槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,并檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體途徑。方法:mtt及單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡及周期分布,hoechst33258染色觀測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡小體,應(yīng)用全凋亡抑制劑z-vad-fmk觀察肝癌細(xì)胞凋亡變化,驗(yàn)證槐耳誘導(dǎo)凋亡。westernblot檢測(cè)周期及凋亡相關(guān)蛋白cyclind1、caspase3/8/9、parp、survivin、p53、bcl-2家族蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)凋亡的具體途徑。結(jié)果:槐耳明顯抑制hepg2、huh7增殖,并呈時(shí)間、濃度依賴性,藥物作用時(shí)間延長(zhǎng),濃度增加,細(xì)胞存活率隨之降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示隨著槐耳濃度的增加,細(xì)胞增殖周期阻滯效果越明顯,周期分布呈現(xiàn)濃度依賴性。周期相關(guān)蛋白cyclind1及cdk2在槐耳作用后表達(dá)顯著下降。在hepg2及huh7細(xì)胞中,槐耳處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著上升,明顯高于對(duì)照組,相應(yīng)的parp、caspase3、8、9出現(xiàn)裂解,表達(dá)量顯著增加。bcl-2家族蛋白中bcl-2、bcl-xl及mcl-1表達(dá)均顯著降低,而bim、bax表達(dá)均顯著升高,同時(shí)抑癌蛋白p53表達(dá)顯著升高。survivin在兩種細(xì)胞中表達(dá)均顯著下降。在應(yīng)用z-vad-fmk后,槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制顯著減弱,細(xì)胞增殖能力顯著回升,凋亡水平顯著下降。而相應(yīng)的槐耳聯(lián)合z-vad-fmk作用后caspase3及parp蛋白表達(dá)量較槐耳組顯著下降。結(jié)論:槐耳能夠阻滯肝癌細(xì)胞由g1期進(jìn)入s期,并抑制cyclind1的表達(dá),與此同時(shí)還能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,并使bcl-2家族抑凋亡蛋白表達(dá)降低,促凋亡蛋白表達(dá)升高。槐耳還能使survivin表達(dá)降低,并提高了p53的表達(dá)。槐耳可能是通過(guò)同時(shí)激活內(nèi)外源凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。第二部分p38mapk信號(hào)通路調(diào)控槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡目的:槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制。方法:westernblot檢測(cè)mapk信號(hào)通路變化;應(yīng)用mapk信號(hào)通路抑制劑后,通過(guò)mtt及流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,westernblot檢測(cè)凋亡標(biāo)志性蛋白改變,明確主要調(diào)控通路;同時(shí)檢測(cè)bcl-2家族蛋白、survivin在mapk抑制劑作用下表達(dá)的改變。結(jié)果:槐耳作用于hepg2及huh7細(xì)胞后,mapk三條主要途徑均活化。erk及jnk在兩種細(xì)胞中4小時(shí)內(nèi)即顯著活化,但隨槐耳作用時(shí)間延長(zhǎng)jnk及erk表達(dá)逐漸下降;p38mapk在兩種細(xì)胞中活化最為顯著。p38mapk抑制劑顯著減弱槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。在hepg2及huh7細(xì)胞中,p38mapk抑制劑可以使肝癌細(xì)胞凋亡率顯著下降,jnk及erk抑制劑則對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡影響較小。mtt及克隆形成結(jié)果顯示p38mapk抑制劑能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的增殖能力,而erk及jnk抑制劑則未能產(chǎn)生顯著影響。相應(yīng)的p38mapk抑制劑作用后cleavedcaspase3及parp表達(dá)顯著下降,jnk抑制劑作用后蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化,erk抑制劑作用后cleavedcaspase3及parp表達(dá)均顯著上升。p38mapk抑制劑顯著影響bcl-2家族蛋白及survivin表達(dá)。在hepg2及huh7細(xì)胞中,加入p38mapk抑制劑后,bcl-2及survivin表達(dá)顯著回升,而bax則顯著下降;jnk抑制劑作用后bcl-2、survivin表達(dá)均提高,但bax表達(dá)變化不同;erk抑制劑作用后bax表達(dá)上升,而bcl-2及survivin表達(dá)則下降。結(jié)論:mapk三條途徑在槐耳作用后均活化,其中p38mapk最為顯著�；倍T導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是主要通過(guò)p38mapk信號(hào)通路調(diào)節(jié)survivin及bcl-2家族蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的。survivin能夠減弱槐耳對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果,聯(lián)合p38mapk抑制劑后能夠進(jìn)一步減弱槐耳的抗癌作用。survivin可能是p38mapk潛在的靶蛋白。第三部分p38mapk信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡及自噬目的:觀察槐耳能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬,明確自噬對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響,研究mapk信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法:westernblot檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白及akt/mtor信號(hào)通路蛋白,電鏡觀察自噬體形成;應(yīng)用自噬抑制劑及誘導(dǎo)劑后mtt及流式細(xì)胞術(shù)觀察自噬對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響;mapk抑制劑作用后觀察肝癌細(xì)胞自噬變化,明確調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬,并抑制akt/mtor信號(hào)通路。p62表達(dá)量隨著槐耳作用時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降,beclin1表達(dá)量和lc3ii/lc3i比值則顯著提高。而自噬上游相關(guān)蛋白akt、mtor及p70s6k在hepg2及huh7中表達(dá)均顯著下降。自噬顯著影響肝癌細(xì)胞的凋亡。在hepg2及huh7細(xì)胞中,rapamycin可以顯著降低槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率;而應(yīng)用cq則使細(xì)胞凋亡略升高,但與槐耳組相比凋亡率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mtt檢測(cè)顯示rapamycin處理肝癌細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力較槐耳組顯著提高,而cq作用后,細(xì)胞增殖率顯著下降。hepg2及huh7細(xì)胞在rapamycin處理后,cleavedcaspase3表達(dá)較槐耳組明顯減少,而parp在rapamycin作用下有所減少;cq作用后,cleavedcaspase3表達(dá)水平顯著提高,而parp表達(dá)量較槐耳組無(wú)顯著差異。p38mapk及jnk參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬。在hepg2及huh7細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,p38mapk抑制劑作用后,細(xì)胞自噬顯著增強(qiáng),beclin1表達(dá)及LC3 II/LC3 I比值顯著提高,而p62表達(dá)顯著下降;JNK抑制劑則使Beclin 1表達(dá)及LC3 II/LC3 I比值下降,p62表達(dá)升高;ERK抑制劑則對(duì)肝癌細(xì)胞自噬水平無(wú)顯著影響,Beclin 1、p62及LC3表達(dá)均未發(fā)生顯著改變。免疫熒光結(jié)果顯示在Hep G2及Huh7細(xì)胞中,p38MAPK抑制劑可以使細(xì)胞中LC3顯著增多,而JNK抑制劑作用后LC3則顯著減少,ERK抑制劑對(duì)LC3無(wú)顯著影響。結(jié)論:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬。自噬在槐耳抑制肝癌細(xì)胞過(guò)程中起到保護(hù)肝癌細(xì)胞的作用,能夠抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。p38MAPK信號(hào)通路參與了槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬,并可能起到抑制自噬的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2248502