【摘要】：槐耳是一種藥用真菌,1600多年前即開始在中國用于抗癌治療,其菌質(zhì)發(fā)酵后的熱水提取物為槐耳清膏。槐耳具有抗腫瘤活性,可以抑制血管及腫瘤形成、抗腫瘤耐藥、抑制癌轉(zhuǎn)移、激活免疫系統(tǒng)以及誘導(dǎo)凋亡等。槐耳主要通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮其抗肝癌的作用,但具體通過什么凋亡途徑、作用的具體靶點、凋亡調(diào)控機制等尚未得到深入研究。近些年自噬研究成為熱點。自噬(Autophagy)是一種進化非常保守的生理過程,在應(yīng)激、饑餓、缺氧以及生長因子缺乏條件下,細胞降解其自身的細胞質(zhì)和細胞器而產(chǎn)生營養(yǎng)成分、生長因子以及能量來支持細胞的生存以及活性,是一種實行 自我消化‖的一系列生化過程。在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程中,自噬可以起到促進和抑制的雙重作用。凋亡與自噬之間存在相互聯(lián)系,自噬可以抑制細胞凋亡,促進細胞生存、增殖,但自噬本身也會觸發(fā)細胞凋亡或誘發(fā)細胞死亡,在與凋亡協(xié)同作用下或在凋亡缺陷的情況下獨自誘導(dǎo)細胞死亡。目前在槐耳抑制肝癌細胞機制研究中,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)自噬的報道,自噬起到什么作用、其與凋亡的關(guān)系仍然不明,值得我們進行探究。腫瘤的形成與發(fā)展與信號通路密切相關(guān)。在與肝癌相關(guān)的信號通路中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要包括胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal-regulated protein kinases,ERK),C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK),和p38激酶(p38MAPK)。MAPK可以通過調(diào)節(jié)B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)家族蛋白調(diào)節(jié)下游基因的表達,從而參與幾乎所有的細胞病理、生理過程,包括細胞周期調(diào)控、細胞存活與死亡、基因表達、細胞運動等。而mapk信號通路也可以通過bcl-2家族蛋白參與對自噬的調(diào)控,p38mapk可以對自噬發(fā)揮促進和抑制雙重作用;jnk與erk則能夠促進細胞自噬。因而在本實驗中,我們對mapk信號通路在槐耳抑制肝癌細胞過程中所起到的作用進行了較為深入的研究。bcl-2家族蛋白是機體清理異常細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在細胞凋亡信號刺激下,抗凋亡和促凋亡的bcl-2家族蛋白之間的平衡以及相互作用影響下游促凋亡蛋白bax和bak的激活。在激活狀態(tài)下,bak和bax的構(gòu)象發(fā)生改變并穿透線粒體外膜導(dǎo)致細胞死亡。目前除了已經(jīng)明確bcl-2可以阻抑線粒體外膜的滲透性,阻止細胞色素c和其他能夠激活蛋白酶和caspase的促凋亡蛋白的釋放外,bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體凋亡的機制仍未完全研究清楚。本研究采用流式細胞分析、mtt、凋亡及自噬相關(guān)抑制劑應(yīng)用、免疫熒光、westernblot等方法,觀察肝癌細胞hepg2及huh7在槐耳處理后的增殖和凋亡的變化;檢測槐耳對凋亡相關(guān)蛋白包括caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及mapk信號通路蛋白、akt/mtor信號通路蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達的影響;采用凋亡抑制劑、自噬誘導(dǎo)或抑制劑后觀察肝癌細胞增殖及凋亡變化,同時檢測caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達,研究槐耳對肝癌細胞增殖、凋亡及自噬的影響,探討其誘導(dǎo)、調(diào)控肝癌細胞凋亡及自噬的相關(guān)機制,為槐耳治療肝癌提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。第一部分槐耳抑制肝癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡目的:觀察槐耳對肝癌細胞增殖及凋亡的影響,并檢測相關(guān)標志蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的具體途徑。方法:mtt及單細胞克隆形成實驗檢測槐耳對肝癌細胞增殖的影響,流式細胞術(shù)檢測肝癌細胞凋亡及周期分布,hoechst33258染色觀測肝癌細胞凋亡小體,應(yīng)用全凋亡抑制劑z-vad-fmk觀察肝癌細胞凋亡變化,驗證槐耳誘導(dǎo)凋亡。westernblot檢測周期及凋亡相關(guān)蛋白cyclind1、caspase3/8/9、parp、survivin、p53、bcl-2家族蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)凋亡的具體途徑。結(jié)果:槐耳明顯抑制hepg2、huh7增殖,并呈時間、濃度依賴性,藥物作用時間延長,濃度增加,細胞存活率隨之降低。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著槐耳濃度的增加,細胞增殖周期阻滯效果越明顯,周期分布呈現(xiàn)濃度依賴性。周期相關(guān)蛋白cyclind1及cdk2在槐耳作用后表達顯著下降。在hepg2及huh7細胞中,槐耳處理細胞后細胞凋亡率顯著上升,明顯高于對照組,相應(yīng)的parp、caspase3、8、9出現(xiàn)裂解,表達量顯著增加。bcl-2家族蛋白中bcl-2、bcl-xl及mcl-1表達均顯著降低,而bim、bax表達均顯著升高,同時抑癌蛋白p53表達顯著升高。survivin在兩種細胞中表達均顯著下降。在應(yīng)用z-vad-fmk后,槐耳對肝癌細胞增殖的抑制顯著減弱,細胞增殖能力顯著回升,凋亡水平顯著下降。而相應(yīng)的槐耳聯(lián)合z-vad-fmk作用后caspase3及parp蛋白表達量較槐耳組顯著下降。結(jié)論:槐耳能夠阻滯肝癌細胞由g1期進入s期,并抑制cyclind1的表達,與此同時還能夠誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生凋亡,并使bcl-2家族抑凋亡蛋白表達降低,促凋亡蛋白表達升高�；倍�能使survivin表達降低,并提高了p53的表達。槐耳可能是通過同時激活內(nèi)外源凋亡途徑來誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生凋亡。第二部分p38mapk信號通路調(diào)控槐耳誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡目的:槐耳誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的具體調(diào)控機制。方法:westernblot檢測mapk信號通路變化;應(yīng)用mapk信號通路抑制劑后,通過mtt及流式細胞術(shù)觀察其對肝癌細胞增殖及凋亡的影響,westernblot檢測凋亡標志性蛋白改變,明確主要調(diào)控通路;同時檢測bcl-2家族蛋白、survivin在mapk抑制劑作用下表達的改變。結(jié)果:槐耳作用于hepg2及huh7細胞后,mapk三條主要途徑均活化。erk及jnk在兩種細胞中4小時內(nèi)即顯著活化,但隨槐耳作用時間延長jnk及erk表達逐漸下降;p38mapk在兩種細胞中活化最為顯著。p38mapk抑制劑顯著減弱槐耳對肝癌細胞的抑制作用。在hepg2及huh7細胞中,p38mapk抑制劑可以使肝癌細胞凋亡率顯著下降,jnk及erk抑制劑則對肝癌細胞凋亡影響較小。mtt及克隆形成結(jié)果顯示p38mapk抑制劑能夠顯著提高肝癌細胞的增殖能力,而erk及jnk抑制劑則未能產(chǎn)生顯著影響。相應(yīng)的p38mapk抑制劑作用后cleavedcaspase3及parp表達顯著下降,jnk抑制劑作用后蛋白表達無顯著變化,erk抑制劑作用后cleavedcaspase3及parp表達均顯著上升。p38mapk抑制劑顯著影響bcl-2家族蛋白及survivin表達。在hepg2及huh7細胞中,加入p38mapk抑制劑后,bcl-2及survivin表達顯著回升,而bax則顯著下降;jnk抑制劑作用后bcl-2、survivin表達均提高,但bax表達變化不同;erk抑制劑作用后bax表達上升,而bcl-2及survivin表達則下降。結(jié)論:mapk三條途徑在槐耳作用后均活化,其中p38mapk最為顯著。槐耳誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡可能是主要通過p38mapk信號通路調(diào)節(jié)survivin及bcl-2家族蛋白來實現(xiàn)的。survivin能夠減弱槐耳對肝癌細胞的抑制效果,聯(lián)合p38mapk抑制劑后能夠進一步減弱槐耳的抗癌作用。survivin可能是p38mapk潛在的靶蛋白。第三部分p38mapk信號通路參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡及自噬目的:觀察槐耳能否誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生自噬,明確自噬對肝癌細胞凋亡的影響,研究mapk信號通路對肝癌細胞自噬的影響及其調(diào)控機制。方法:westernblot檢測自噬標志性蛋白及akt/mtor信號通路蛋白,電鏡觀察自噬體形成;應(yīng)用自噬抑制劑及誘導(dǎo)劑后mtt及流式細胞術(shù)觀察自噬對肝癌細胞增殖及凋亡的影響;mapk抑制劑作用后觀察肝癌細胞自噬變化,明確調(diào)控機制。結(jié)果:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生自噬,并抑制akt/mtor信號通路。p62表達量隨著槐耳作用時間的延長顯著下降,beclin1表達量和lc3ii/lc3i比值則顯著提高。而自噬上游相關(guān)蛋白akt、mtor及p70s6k在hepg2及huh7中表達均顯著下降。自噬顯著影響肝癌細胞的凋亡。在hepg2及huh7細胞中,rapamycin可以顯著降低槐耳誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡率;而應(yīng)用cq則使細胞凋亡略升高,但與槐耳組相比凋亡率變化無統(tǒng)計學(xué)意義。mtt檢測顯示rapamycin處理肝癌細胞后,細胞增殖能力較槐耳組顯著提高,而cq作用后,細胞增殖率顯著下降。hepg2及huh7細胞在rapamycin處理后,cleavedcaspase3表達較槐耳組明顯減少,而parp在rapamycin作用下有所減少;cq作用后,cleavedcaspase3表達水平顯著提高,而parp表達量較槐耳組無顯著差異。p38mapk及jnk參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬。在hepg2及huh7細胞中,與對照組相比,p38mapk抑制劑作用后,細胞自噬顯著增強,beclin1表達及LC3 II/LC3 I比值顯著提高,而p62表達顯著下降;JNK抑制劑則使Beclin 1表達及LC3 II/LC3 I比值下降,p62表達升高;ERK抑制劑則對肝癌細胞自噬水平無顯著影響,Beclin 1、p62及LC3表達均未發(fā)生顯著改變。免疫熒光結(jié)果顯示在Hep G2及Huh7細胞中,p38MAPK抑制劑可以使細胞中LC3顯著增多,而JNK抑制劑作用后LC3則顯著減少,ERK抑制劑對LC3無顯著影響。結(jié)論:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生自噬。自噬在槐耳抑制肝癌細胞過程中起到保護肝癌細胞的作用,能夠抑制肝癌細胞的凋亡。p38MAPK信號通路參與了槐耳誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬,并可能起到抑制自噬的作用。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2248502