【摘要】：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第五大常見惡性腫瘤,且位居腫瘤相關(guān)性死亡的第三位。以手術(shù)切除為主的綜合治療手段廣泛應(yīng)用于臨床,然而,預(yù)后較差仍是亟待解決的問題,主要原因是術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,具體導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不明確。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)是指腫瘤組織中存在的少數(shù)具備高度增殖、自我更新能力及多向分化潛能的細(xì)胞,在啟動(dòng)腫瘤形成和生長中起著決定性作用。隨著對(duì)CSCs研究的不斷深入及從肝癌組織和細(xì)胞系中分離出肝癌干細(xì)胞,肝癌中存在肝癌干細(xì)胞的觀點(diǎn)正被廣大學(xué)者接受,這種細(xì)胞成瘤能力強(qiáng),是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)�。殺滅腫瘤干細(xì)胞或抑制其增殖可能是減少術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵,但這類細(xì)胞對(duì)放療和化療均不敏感,針對(duì)這類細(xì)胞目前缺少有效的治療方法。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2, COX-2)是一個(gè)非常重要的腫瘤相關(guān)基因,已證實(shí)COX-2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),它能夠抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,以及促進(jìn)腫瘤血管生成,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最新研究表明COX-2亦在調(diào)控CSCs增殖、自我更新、侵襲力及放療敏感性等方面發(fā)揮重要作用。因此,以COX-2作為CSCs研究的一個(gè)切入點(diǎn),有望為臨床根治腫瘤和預(yù)防復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移提供新思路。研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可明顯降低罹患結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌及卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn),因而使用COX-2抑制劑預(yù)防腫瘤生長和復(fù)發(fā)有極大的潛在價(jià)值。目前,尚無相關(guān)研究證實(shí)COX-2參與調(diào)控肝癌干細(xì)胞,亦無相關(guān)研究報(bào)道COX-2抑制劑能夠抑制肝癌干細(xì)胞特性,因此值得深入研究。一旦上述兩個(gè)疑問被解開,將為應(yīng)用COX-2抑制劑預(yù)防肝癌生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株HCCLM3中側(cè)群細(xì)胞分離及干細(xì)胞特性鑒定目的：應(yīng)用紫外光激發(fā)的流式細(xì)胞熒光活化分選法(fluorescence-activated cell sorting, MACS)分選高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株HCCLM3中的側(cè)群細(xì)胞(side population, SP),并探討其生物學(xué)特性。方法：常規(guī)培養(yǎng)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H、 MHCC97-L及Huh7,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后制備單細(xì)胞懸液,分別予以不同終濃度熒光染料Hoechst33342染色,以維拉帕米拮抗組為對(duì)照。流式細(xì)胞儀檢測Hoechst33342熒光,紫外光激發(fā)產(chǎn)生兩種散射光信號(hào),以Hoechst Blue為Y軸,Hoechst Red為X軸作二維散點(diǎn)圖,將低Hoechst Blue及低Hoechst Red且對(duì)照組缺失的區(qū)域定義為SP細(xì)胞的“門”,多數(shù)細(xì)胞集中區(qū)域?yàn)橹魅?main population, MP)細(xì)胞。從肝癌細(xì)胞株HCCLM3中分選SP細(xì)胞和MP細(xì)胞,于熒光顯微鏡觀察SP細(xì)胞及MP細(xì)胞內(nèi)Hoechst33342染料熒光強(qiáng)度差異。應(yīng)用體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察SP及MP細(xì)胞的自我更新能力,CCK8細(xì)胞增殖及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察SP及MP細(xì)胞的增殖及克隆形成能力,CCK8法觀察化療藥物對(duì)SP及MP細(xì)胞生長的抑制作用,Transwell實(shí)驗(yàn)觀察SP及MP細(xì)胞的遷移和侵襲能力,應(yīng)用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察SP及MP細(xì)胞的致瘤能力；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SP及MP細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀檢測SP及MP細(xì)胞中干細(xì)胞表面標(biāo)記物ABCG2、CD133、CD90、EpCAM、CD13、CD44表達(dá)情況。結(jié)果：人肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中均存在SP細(xì)胞,比例分別為(16.9+1.8)%、(8.4+0.7)%、(4.6+0.5)%、(1.0+0.2)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；為滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求,選擇高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株HCCLM3進(jìn)行分選。熒光顯微鏡下觀察SP細(xì)胞中Hoechst33342的熒光強(qiáng)度明顯弱于MP細(xì)胞。體外培養(yǎng)時(shí)SP細(xì)胞可產(chǎn)生SP及MP細(xì)胞,而MP細(xì)胞不能產(chǎn)生SP細(xì)胞；SP細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于MP細(xì)胞(P0.05)；SP細(xì)胞形成的克隆球體積更大,結(jié)構(gòu)更緊密,克隆形成率高達(dá)(35.6+4.4)%,明顯高于MP細(xì)胞(10.2±3.1)%(P0.05)；SP細(xì)胞具備較強(qiáng)的抵抗化療藥物作用(P0.05)；Transwell實(shí)驗(yàn)提示SP細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯高于MP細(xì)胞(均P0.05)；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中5×103個(gè)SP細(xì)胞即可在4w觀察期內(nèi)形成皮下移植瘤,而MP細(xì)胞則需要5×105個(gè)才能形成皮下移植瘤。PCR結(jié)果示SP細(xì)胞中Nanog、Sox2、 Klf4、Sall4和Oct4 mRNA平均表達(dá)水平分別是MP細(xì)胞的3.78、2.37、2.92、1.83、1.46倍；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示SP細(xì)胞中干細(xì)胞表面標(biāo)記物ABCG2、CD90及CD13的陽性表達(dá)率明顯高于MP細(xì)胞(均P0.05),SP和MP細(xì)胞幾乎全部表達(dá)CD44,但不表達(dá)CD133和EpCAM。結(jié)論：不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中存在不同比例的SP細(xì)胞,可能與肝癌的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)；應(yīng)用MACS可穩(wěn)定分選HCCLM3中的SP細(xì)胞及MP細(xì)胞。HCCLM3細(xì)胞中SP細(xì)胞富集了肝癌干細(xì)胞,可能與其較高的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。二、慢病毒介導(dǎo)COX-2過表達(dá)對(duì)肝癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響目的：探討環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)在SP細(xì)胞及MP細(xì)胞中的表達(dá)情況；構(gòu)建重組慢病毒COX-2基因過表達(dá)載體并感染高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞株HCCLM3,探討COX-2過表達(dá)對(duì)SP細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響及分子機(jī)制。方法：從肝癌細(xì)胞株HCCLM3中分選SP細(xì)胞和MP細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法檢測SP細(xì)胞及MP細(xì)胞中COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)。另外,取對(duì)數(shù)生長期人肝癌細(xì)胞HCCLM3接種于培養(yǎng)板中,分為3組：感染COX-2基因重組慢病毒過表達(dá)載體為轉(zhuǎn)染組(LV-COX-2組)；感染慢病毒空載體為陰性對(duì)照組(LV-NC組)；空白對(duì)照組不做任何處理。流式細(xì)胞儀分選三組細(xì)胞中SP細(xì)胞。采用CCK8細(xì)胞增殖及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察SP細(xì)胞的增殖及克隆形成能力,裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察SP細(xì)胞的致瘤能力。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定SP細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blotting技術(shù)檢測SP細(xì)胞中COX-2 PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：PCR結(jié)果示SP細(xì)胞中COX-2 mRNA平均表達(dá)水平是MP細(xì)胞的17.45倍(P0.05)；Western blotting結(jié)果示SP細(xì)胞中COX-2蛋白平均表達(dá)水平是MP細(xì)胞的9.23倍(P0.05)。LV-COX-2/HCCLM3中SP細(xì)胞含量為(19.9+1.4)%,明顯多于LV-NC/HCCML3(17.3±0.6)%及HCCLM3(16.9+1.8)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LV-COX-2/SP細(xì)胞增殖及克隆形成能力均明顯強(qiáng)于LV-NC/SP細(xì)胞和SP細(xì)胞(均P0.05)；LV-COX-2/SP細(xì)胞形成裸鼠皮下移植瘤平均體積明顯大于LV-NC細(xì)胞和SP細(xì)胞(均P0.05)。 PCR及western blotting結(jié)果示LV-COX-2/SP細(xì)胞中COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)較LV-NC/SP細(xì)胞和SP細(xì)胞明顯上調(diào),而PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。LV-COX-2/SP細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量較LV-NC/SP細(xì)胞及SP細(xì)胞明顯增加(均P0.05)。結(jié)論：COX-2過表達(dá)能夠促進(jìn)SP細(xì)胞干細(xì)胞特性,提示COX-2可能通過下調(diào)PTEN及PDCD4激活肝癌干細(xì)胞。三、COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對(duì)肝癌干細(xì)胞的抑制作用目的：探討選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)SP細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響。方法：從肝癌細(xì)胞株HCCLM3中分離SP細(xì)胞,采用CCK8法觀察塞來昔布對(duì)其增殖能力的影響,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察塞來昔布對(duì)其克隆能力的影響,Annexin V/7-AAD雙染色法檢測塞來昔布誘導(dǎo)其凋亡的情況。裸鼠皮下接種SP細(xì)胞后隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組給予塞來昔布灌胃,對(duì)照組給予生理鹽水灌胃,觀察裸鼠皮下移植瘤形成情況。采用ELISA法測定SP細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blotting檢測SP細(xì)胞中COX-2、PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：塞來昔布對(duì)SP細(xì)胞增殖有顯著抑制作用,呈時(shí)間和劑量依賴性；塞來昔布明顯降低SP細(xì)胞的克隆形成能力(P0.05)；也能夠誘導(dǎo)SP細(xì)胞凋亡,呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組裸鼠皮下均形成皮下移植瘤,但前者移植瘤平均體積明顯小于后者(P0.05)。經(jīng)塞來昔布處理后,SP細(xì)胞中COX-2表達(dá)下調(diào),而PTEN及PDCD4明顯上調(diào)：隨著藥物濃度的增加,SP細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量逐漸降低。結(jié)論：塞來昔布能夠抑制SP細(xì)胞增殖及克隆能力,誘導(dǎo)SP細(xì)胞凋亡,并對(duì)裸鼠皮下移植瘤有明顯抑制作用,說明塞來昔布可能通過上調(diào)PTEN及PDCD4抑制肝癌干細(xì)胞特性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2245647