【摘要】：第一部分負(fù)載AIE分子的雙信號(hào)核磁造影劑對(duì)腫瘤靶向成像的應(yīng)用及毒性研究 目的：依賴EPR效應(yīng),研究負(fù)載AIE分子的雙信號(hào)核磁造影劑四苯基乙烯-2釓(TPE-2Gd)在腫瘤靶向成像中的效果,評(píng)價(jià)TPE-2Gd在細(xì)胞、動(dòng)物水平的毒性作用 方法：①建立小鼠皮下腫瘤模型,尾靜脈分別注射TPE-2Gd和商業(yè)造影劑馬根維顯,采用核磁共振儀對(duì)小鼠腫瘤部位行核磁掃描檢查,比較TPE-2Gd與馬根維顯在皮下腫瘤成像中的效果。②在細(xì)胞水平,HE染色觀察TPE-2Gd處理后,細(xì)胞形態(tài)改變；采用CCK8觀察TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。采用活性氧熒光探針DCFH-DA,流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡兩種方法檢測(cè)TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的影響。采用PI/Annexin V染色觀察TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死的影響。③在動(dòng)物水平,采取SD大鼠動(dòng)脈血行溶血試驗(yàn),觀察TPE-2Gd對(duì)血細(xì)胞的毒性作用。以SD大鼠為模型,靜脈注射TPE-2Gd或生理鹽水,觀察兩組在不同時(shí)點(diǎn)大鼠的行為、體重改變。抽血檢測(cè)兩組動(dòng)物血細(xì)胞、血紅蛋白量、炎性細(xì)胞等血象指標(biāo),檢查肝內(nèi)酶學(xué)、血肌酐尿素氮等指標(biāo)判斷大鼠肝腎功能改變。在不同時(shí)點(diǎn),頸椎脫臼法處死大鼠后,取重要內(nèi)臟器官行HE染色觀察有無(wú)炎性改變。 結(jié)果：①予小鼠皮下注射同種屬來(lái)源的H22肝癌細(xì)胞,成功構(gòu)建了皮下腫瘤模型。核磁共振儀掃描結(jié)果顯示TPE-2Gd組和馬根維顯組藥物注射后較平掃期腫瘤部位信號(hào)均增強(qiáng)。而TPE-2Gd組較馬根維顯組磁共振信號(hào)增強(qiáng)效果更明顯,且TPE-2Gd組在腫瘤部位衰減更慢,滯留時(shí)間更長(zhǎng)。②細(xì)胞水平,細(xì)胞HE染色提示TPE-2Gd對(duì)HeLa細(xì)胞及3T3細(xì)胞的形態(tài)改變均無(wú)影響。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖毒性小,生物相溶性好。細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)表明TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和增加無(wú)影響。細(xì)胞凋亡和壞死的研究表明TPE-2Gd未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生及細(xì)胞壞死的增加。③動(dòng)物水平,溶血試驗(yàn)表明TPE-2Gd未誘發(fā)紅細(xì)胞破裂,溶血發(fā)生。予尾靜脈注射TPE-2Gd組和生理鹽水組在SD大鼠生長(zhǎng)過程中的精神狀態(tài),體重增長(zhǎng)速度等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,各血象指標(biāo)亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,注射TPE-2Gd組肝腎功能較生理鹽水組無(wú)差別。兩組在不同時(shí)點(diǎn)采集的各組織器官HE染色未見炎性改變。結(jié)論：本研究成功建立小鼠皮下腫瘤模型,并通過核磁儀檢測(cè)TPE-2Gd作為新型雙信號(hào)核磁造影劑對(duì)皮下腫瘤的靶向成像效果。帶有2個(gè)Gd原子的TPE-2Gd較只有1個(gè)Gd原子的馬根維顯對(duì)皮下腫瘤有更好的信號(hào)增強(qiáng)效果,以納米形式存在的TPE-2Gd依賴EPR效應(yīng)更易滯留于腫瘤組織中,增加了腫瘤成像的靶向性。作為活體應(yīng)用的生物材料,材料的生物相容性、細(xì)胞毒性和材料對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)繁殖的影響是重要的檢測(cè)項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平證明了TPE-2Gd對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖和活性氧的產(chǎn)生均無(wú)影響,對(duì)誘導(dǎo)溶血的發(fā)生及細(xì)胞凋亡亦無(wú)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明TPE-2Gd對(duì)SD大鼠的精神狀態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育及肝腎功能等均無(wú)影響,亦無(wú)誘導(dǎo)體內(nèi)炎癥的發(fā)生。綜上所述負(fù)載有AIE熒光分子的新型雙信號(hào)核磁造影劑毒性小,生物相溶性好,且可增強(qiáng)造影信號(hào)強(qiáng)度,延長(zhǎng)成像時(shí)間,有望成為新一代優(yōu)良的腫瘤靶向成像材料。 第二部分基于AIE發(fā)光機(jī)理的線粒體熒光探針的合成、表征及在細(xì)胞自噬研究中的應(yīng)用 目的：制備具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)特性的線粒體熒光探針(TPE-Py-NCS),評(píng)價(jià)熒光探針的理化特性、AIE特性和光穩(wěn)定性以及生物親和性,并探討其在觀察線粒體自噬中的應(yīng)用價(jià)值。 方法：將TPE-Py-N3經(jīng)化學(xué)修飾得到TPE-Py-NCS分子。通過核磁(NMR)、高分辨質(zhì)譜(HRMS)分析檢測(cè)產(chǎn)物TPE-Py-NCS化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定納米顆粒的水合粒徑、分散性,紫外/可見光譜儀、熒光分光光度計(jì)表征TPE-Py-NCS的光物理性能。以不同比例的二甲基亞砜(DMSO)和水的混合溶液觀察TPE-Py-NCS的AIE特性。MTT法評(píng)價(jià)TPE-Py-NCS的細(xì)胞毒性。以相似相容原理,采用丙酮沖洗染色后的細(xì)胞,判斷熒光探針與線粒體的結(jié)合方式。若該熒光探針與線粒體只是電荷吸引結(jié)合,則該探針容易被有機(jī)溶劑如丙酮溶解,并沖洗掉。若該熒光探針與線粒體通過化學(xué)反應(yīng)結(jié)合,則該探針不能被有機(jī)溶劑溶解、沖洗。以CCCP處理細(xì)胞致線粒體膜電位降低,觀察熒光探針TPE-Py-NCS在線粒體電位降低后的熒光染色表現(xiàn)。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)連續(xù)激發(fā)染色細(xì)胞以評(píng)價(jià)熒光探針的光穩(wěn)定性。以雷帕霉素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬發(fā)生,CLSM采集自噬發(fā)生后不同時(shí)間點(diǎn)圖像,觀察自噬過程中線粒體與溶酶體的融合過程。同時(shí)CLSM連續(xù)激發(fā)染色細(xì)胞比較新型AIE探針(TPE-Py-NCS)與傳統(tǒng)商用MitoTracker(?) Red CMXRos探針在自噬中的光穩(wěn)定性表現(xiàn)。 結(jié)果：合成得到TPE-Py-NCS分子,核磁(NMR)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)驗(yàn)證無(wú)誤。DLS檢測(cè)顯示TPE-Py-NCS在含0.1%的DMSO的水溶液中,粒徑為納米級(jí),分散性好。紫外/可見光譜儀、熒光分光光度計(jì)顯示TPE-Py-NCS在DMSO溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為397nm,最大發(fā)射峰在638nm。不同比例的DMSO/H_2O的混合溶液證明了TPE-Py-NCS的AIE特性,即TPE-Py-NCS在良溶劑中處于溶解狀態(tài),發(fā)微弱熒光,在不良溶劑中聚集,熒光增強(qiáng)。MTT結(jié)果顯示TPE-Py-NCS對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖毒性小,生物相溶性好,可用于細(xì)胞染色。細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPE-Py-NCS可特異性靶向線粒體染色,選擇性和特異性好,與商業(yè)化的線粒體熒光探針共染的重疊率達(dá)97%。該熒光探針既可染活細(xì)胞也可對(duì)固定后的細(xì)胞染色。TPE-Py-NCS與線粒體結(jié)合力實(shí)驗(yàn)顯示,TPE-Py-NCS對(duì)CCCP處理后的膜電位降低的線粒體仍可染色。細(xì)胞染色后用丙酮沖洗細(xì)胞仍清晰可見標(biāo)有黃色熒光的線粒體,提示TPE-Py-NCS與線粒體以化學(xué)鍵結(jié)合。CLSM連續(xù)激發(fā)染色細(xì)胞證實(shí)該熒光探針的光穩(wěn)定性良好,可持續(xù)激發(fā)掃描10分鐘以上。以TPE-Py-NCS為黃色線粒體熒光探針,LysoTracker Red為溶酶體紅色熒光探針,雷帕霉素誘導(dǎo)后72分鐘見細(xì)胞內(nèi)有自噬溶酶體出現(xiàn),持續(xù)約8分鐘后消失。CLSM連續(xù)激發(fā)染色細(xì)胞可見TPE-Py-NCS比MitoTracker Red光穩(wěn)定性更好,可用于持續(xù)觀察細(xì)胞的自噬過程。 結(jié)論：通過TPE-Py-N3與CS2的反應(yīng),得到了TPE-Py-NCS熒光探針,該熒光探針帶正電荷,可特異性結(jié)合膜電位為負(fù)值的細(xì)胞器--線粒體。以靜電吸引與線粒體結(jié)合后,該探針的NCS官能團(tuán)可與線粒體蛋白的NH2反應(yīng),以化學(xué)鍵緊密結(jié)合在線粒體上,可抵御線粒體周圍的各種微環(huán)境變化,如在自噬過程中會(huì)出現(xiàn)的去極化及區(qū)域性酸化等。TPE-Py-NCS具有AIE特性,即在良溶劑中熒光較弱,在不良溶劑如PBS、細(xì)胞培養(yǎng)基中熒光增強(qiáng)。該熒光探針以良好的生物相容性用于細(xì)胞染色,并表現(xiàn)出良好的光穩(wěn)定性。在觀察白噬這樣一個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)的過程中,良好的抗光漂白作用是熒光探針必須具備的關(guān)鍵特征。TPE-Py-NCS在觀察自噬過程中表現(xiàn)出了良好的抗光漂白效果,為自噬過程的研究提供了幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-3

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本文編號(hào)：2239658