【摘要】：可變剪接(alternative splicing,AS)在許多生理病理過程中發(fā)揮重要的作用,并且剪接失調是腫瘤發(fā)生的重要特征之一。我們知道,來自同一基因的不同產(chǎn)物可能對腫瘤產(chǎn)生不同的影響。因此,深入研究可變剪接因子和可變剪接事件在腫瘤發(fā)生中的作用,可為腫瘤的靶向治療找到一些新的思路。在研究中我們發(fā)現(xiàn)一個剪接因子MBNL3,它具有癌胚特性,能夠促進肝癌的發(fā)生。首先,我們在胎肝和成年肝組織中檢測了MBNL3的表達,發(fā)現(xiàn)MBNL3在胎肝組織中高表達。然后,在肝癌和癌旁肝組織中檢測MBNL3的表達,并分析其與臨床病理特征的相關性,發(fā)現(xiàn)MBNL3在肝癌組織中高表達并與肝癌病人的不良預后相關,可能驅動腫瘤的發(fā)生。進一步的研究發(fā)現(xiàn)干細胞轉錄因子OCT4、SOX2、NANOG上調MBNL3的表達。在肝癌細胞和肝細胞中過表達MBNL3,CCK-8、乙炔脫氧尿苷結合染色(EdU)和克隆形成等增殖實驗,TUNEL、凋亡標志因子檢測等凋亡實驗,以及動物體內荷瘤實驗,表明MBNL3能夠促進肝癌細胞和未轉化肝細胞的增殖、抑制其凋亡、促進體內腫瘤生長。而敲減MBNL3后抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡。最后,我們在MBNL3本底表達量不同的多種肝癌細胞系和肝細胞系中敲減MBNL3,研究其對腫瘤發(fā)生的作用。最終發(fā)現(xiàn),敲減MBNL3可顯著抑制肝癌細胞體內外的生長,并且對MBNL3高表達的細胞株作用更強烈。鑒于MBNL3強大的生物學功能,我們對其下游分子進行分析。轉錄組測序結果表明MBNL3可以調控POLDIP3的可變剪接,所以,我們錨定POLDIP3的不同轉錄本進行研究。POLDIP3是核糖體蛋白S6激酶1的靶標,它能夠調節(jié)DNA的復制和mRNA的翻譯。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)POLDIP3有POLDIP3-α和POLDIP3-β兩個轉錄本,其中POLDIP3-α包含外顯子3,POLDIP3-β缺少外顯子3,進而缺失了29個氨基酸。通過檢測POLDIP3-α和POLDIP3-β在臨床肝癌組織和癌旁肝組織中的表達,我們發(fā)現(xiàn),相較于癌旁肝組織,POLDIP3-β在肝癌組織中顯著上調。通過Glo細胞活力實驗,EdU實驗,克隆形成實驗,檢測POLDIP3兩個轉錄本對肝癌細胞增殖的影響;通過TUNEL實驗,膜聯(lián)蛋白V-碘化丙啶染色和流式細胞術,研究POLDIP3兩個轉錄本在肝癌細胞凋亡方面的作用;利用transwell實驗和劃痕實驗檢測POLDIP3兩個轉錄本對肝癌細胞遷移的作用。體外功能學實驗結果證明POLDIP3-β能夠顯著促進肝癌細胞的增殖,抑制肝癌細胞的凋亡,加速肝癌細胞的遷移。然而,POLDIP3-α對肝癌細胞的增殖、凋亡、轉移的作用相對較弱。最后,在動物體內檢測POLDIP3-β對體內腫瘤的影響,發(fā)現(xiàn)POLDIP3-β可顯著促進體內肝癌細胞的生長。以上數(shù)據(jù)表明POLDIP3-β在肝癌中上調表達,并且在肝癌中發(fā)揮著癌基因的作用。選擇性的靶向抑制POLDIP3-β這個轉錄本有望成為肝癌的一個新的治療策略。我們的研究揭示了癌胚性的可變剪接因子、可變剪接事件與腫瘤發(fā)生的關系,同時,確立可變剪接因子和可變剪接事件可以作為潛在的治療靶標。
[Abstract]:Variable splicing (alternative splicing,AS) plays an important role in many physiological and pathological processes, and splicing imbalance is one of the important characteristics of tumorigenesis. We know that different products from the same gene may have different effects on tumors. Therefore, a further study on the role of variable splicing factors and splicing events in tumorigenesis can provide some new ideas for tumor targeting therapy. In our study, we found a splicing factor, MBNL3, which has carcinoembryonic properties and promotes the development of liver cancer. First, we detected the expression of MBNL3 in fetal liver and adult liver tissue, and found that MBNL3 was highly expressed in fetal liver tissue. Then, the expression of MBNL3 was detected in liver cancer and adjacent liver tissues, and its correlation with clinicopathological features was analyzed. It was found that the high expression of MBNL3 in HCC tissues and the poor prognosis of HCC patients may drive the development of tumor. Further studies revealed that stem cell transcription factor OCT4,SOX2,NANOG up-regulated the expression of MBNL3. MBNL3,CCK-8, was overexpressed in hepatoma cells and hepatocytes. The proliferative tests such as Tunel, detection of apoptotic marker factors, and tumor-bearing experiments in vivo, such as (EdU) staining and clone formation, were detected in hepatoma cells and hepatocytes. The results showed that MBNL3 could promote the proliferation of hepatoma cells and untransformed hepatocytes, inhibit their apoptosis, and promote tumor growth in vivo. Knockout MBNL3 inhibited the proliferation of hepatoma cells and promoted their apoptosis. Finally, we studied the role of knockout MBNL3, in tumorigenesis in various hepatoma cell lines and hepatocyte lines with different MBNL3 background expression. It was found that knockout MBNL3 could significantly inhibit the growth of hepatoma cells in vitro and in vivo, and had a stronger effect on cell lines with high MBNL3 expression. In view of the strong biological function of MBNL3, we analyze its downstream molecules. The results of transcriptome sequencing show that MBNL3 can regulate the variable splicing of POLDIP3. Therefore, we anchor the different transcripts of POLDIP3 to study. POLDIP3 is the target of ribosomal protein S6 kinase 1, which can regulate the replication of DNA and the translation of mRNA. In this study, we found that POLDIP3 has two transcripts of POLDIP3- 偽 and POLDIP3- 尾, in which POLDIP3- 偽 contains exon 3, POLDIP3- 尾, and then lacks 29 amino acids. By detecting the expression of POLDIP3- 偽 and POLDIP3- 尾 in clinical and para-cancerous liver tissues, we found that POLDIP3- 尾 was significantly up-regulated in HCC tissues compared with paracarcinomatous liver tissues. The effects of two transcripts of POLDIP3 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells were detected by Glo cell viability assay and clone formation assay. To study the role of POLDIP3 two transcripts in the apoptosis of hepatoma cells, and to detect the effect of POLDIP3 two transcripts on the migration of HCC cells by transwell assay and scratch test. The results of functional experiments in vitro showed that POLDIP3- 尾 could significantly promote the proliferation of hepatoma cells, inhibit the apoptosis of hepatoma cells, and accelerate the migration of hepatoma cells. However, POLDIP3- 偽 has a relatively weak effect on the proliferation, apoptosis and metastasis of hepatoma cells. Finally, the effect of POLDIP3- 尾 on tumor in vivo was detected in animals. It was found that POLDIP3- 尾 could significantly promote the growth of hepatoma cells in vivo. The above data suggest that POLDIP3- 尾 is up-regulated in HCC and plays an oncogene role in HCC. Selective targeting inhibition of POLDIP3- 尾 is expected to be a new therapeutic strategy for HCC. Our study revealed the relationship between the variable splicing factor, the variable splicing event and the tumorigenesis. At the same time, we established that the variable splicing factor and the variable splicing event can be used as potential therapeutic targets.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2227922