【摘要】：線粒體是高度動態(tài)的細胞器,處于不斷的分裂與融合的平衡動態(tài)過程中。線粒體的分裂融合除了對維持線粒體形態(tài)、鈣穩(wěn)態(tài)、ROS產(chǎn)生[1,2]等方面有重要作用外,還對細胞代謝、增殖、遷移[3-5]有重要影響。研究表明,三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的預后較普通非三陰性乳腺癌差[6],其原因可能與腫瘤細胞存活能力增強[7,8]及缺乏有效的靶向治療有關(guān),但具體機制尚未完全明確。本課題以線粒體分裂融合為切入點,探究線粒體分裂融合動態(tài)平衡對三陰性乳腺癌細胞存活的影響及其機制。目的本項目以三陰性乳腺癌為研究對象,選擇介導線粒體分裂的分子Drp1、介導線粒體融合的分子Mfn1為切入點,探究:(1)、三陰性乳腺癌中線粒體分裂融合分布狀態(tài)及其與預后的相關(guān)性;(2)、線粒體分裂融合調(diào)控三陰性乳腺癌細胞生長的作用;(3)、線粒體分裂融合調(diào)控三陰性乳腺癌細胞生長的機制。材料與方法1、用透射電子顯微鏡(TEM)觀察三陰性乳腺癌臨床標本線粒體分裂融合分布狀態(tài),統(tǒng)計學分析預后相關(guān)性。2、用免疫組化(IHC)、Western blot、qRT-PCR檢測三陰性乳腺癌臨床組織樣本與細胞中Drp1和Mfn1蛋白質(zhì)、mRNA水平。3、細胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建Drp1介導的線粒體分裂、Mfn1介導的線粒體融合三陰性乳腺癌細胞模型。4、MTS實驗檢測Drp1/Mfn1介導的線粒體分裂融合細胞模型的細胞活力。5、裸鼠乳腺原位成瘤實驗檢測Drp1/Mfn1介導的線粒體分裂融合細胞模型的成瘤能力。6、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)、TUNEL染色檢測Drp1/Mfn1介導的線粒體分裂融合對細胞凋亡的影響。7、Eud實驗和IHC Ki67染色檢測Drp1/Mfn1介導的線粒體分裂融合對細胞增殖的作用。8、Western blot、IHC檢測Drp1、Mfn1、Notch1、NICD1蛋白水平變化、Mito Traker Green染色檢測線粒體形態(tài)探究線粒體分裂融合與Notch信號的交互作用。9、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)和Edu分別檢測線粒體分裂融合與Notch信號交互作用對細胞凋亡、增殖的影響。10、Western blot檢測線粒體分裂融合與Notch信號交互作用對Survivin蛋白表達的調(diào)控。11、MST實驗驗證Survivin介導的線粒體分裂融合與Notch信號交互對細胞活力的影響。結(jié)果1、線粒體分裂在三陰性乳腺癌中增加、融合減少,并且介導線粒體分裂的Drp1表達與TNBC預后呈負相關(guān),介導線粒體融合的Mfn1表達與預后呈正相關(guān)。2、Drp1介導的線粒體分裂促進三陰性乳腺癌細胞存活、增殖、抑制細胞凋亡;Mfn1介導的線粒體融合抑制三陰性乳腺癌細胞存活、增殖、促進細胞凋亡。3、Drp1介導的線粒體分裂促進Notch1表達和NICD1活化、Mfn1介導的線粒體融合抑制Notch1表達和NICD1活化。4、Notch信號激活促進線粒體分裂、抑制線粒體融合。5、線粒體分裂與Notch信號的交互作用抑制細胞凋亡、促進細胞增殖,并且正向調(diào)控Survivin的表達。6、Survivin介導了線粒體分裂與Notch信號的交互作用對三陰性乳腺癌細胞活力的影響。結(jié)論本課題明確了線粒體分裂與Notch信號通路的正向反饋調(diào)控作用,并且其通過survivin介導,促進了三陰性乳腺癌細胞增殖以及抑制細胞凋亡。
[Abstract]:Mitochondria are highly dynamic organelles in the process of constant division and fusion. Mitochondrial division and fusion not only play an important role in maintaining mitochondrial morphology, calcium homeostasis, ROS production [1,2], but also have an important impact on cell metabolism, proliferation and migration [3-5]. The prognosis of breast cancer (TNBC) is worse than that of non-tri-negative breast cancer (6). The reason may be related to the enhancement of tumor cell viability [7,8] and the lack of effective targeted therapy, but the specific mechanism is not fully clear. The aim of this project is to investigate the distribution of mitochondrial fission and fusion and its relationship with prognosis in triple-negative breast cancer. (2) Mitochondrial fission and fusion regulation. Materials and Methods 1. The distribution of mitochondrial fission and fusion was observed by transmission electron microscopy (TEM), and the prognostic correlation was analyzed statistically. 2. Immunohistochemistry (IHC), Western blot, and qRT-PCR were used. Drp1 and Mfn1 proteins and mRNA levels were detected in clinical tissue samples and cells of triple-negative breast cancer. Mitochondrial division mediated by Drp1 and triple-negative breast cancer cell model mediated by Mfn1 were constructed by cell transfection. 4. MTS assay was used to detect the cell viability of the triple-negative breast cancer cell model mediated by Drp1/Mfn1. Tumor formation assay was used to detect the tumorigenic ability of Drp1/Mfn1-mediated mitochondrial division and fusion cell model.6, Annexin V-FITC/PI flow cytometry, TUNEL staining to detect the effect of Drp1/Mfn1-mediated mitochondrial division and fusion on cell apoptosis.7, Eud test and IHC Ki67 staining to detect the effect of Drp1/Mfn1-mediated mitochondrial division and fusion on cell proliferation. Mito Traker Green staining was used to detect mitochondrial morphology to explore the interaction between mitochondrial fission fusion and Notch signal. 9. Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Edu were used to detect the effects of mitochondrial fission fusion and Notch signal interaction on apoptosis and proliferation, respectively. 10. Western blot was used to detect the regulatory effect of mitochondrial mitotic fusion and Notch signaling on the expression of Survivin protein. 11. MST assay verified the effect of Survivin-mediated mitochondrial fusion and Notch signaling interaction on cell viability. Results 1. Mitochondrial division increased, fusion decreased and mitochondrial division mediated by Survivin-mediated mitochondrial fusion in triple-negative breast cancer. The expression of Drp1 was negatively correlated with the prognosis of TNBC, and the expression of MFn1 mediated mitochondrial fusion was positively correlated with the prognosis. Mitochondrial fusion mediated by Mfn1 inhibits Notch1 expression and NICD1 activation. 4. Notch signal activation promotes mitochondrial division and inhibits mitochondrial fusion. 5. The interaction of mitochondrial division and Notch signal inhibits cell apoptosis, promotes cell proliferation, and positively regulates the expression of Survivin. Conclusion This study clarifies the positive feedback regulation of mitochondrial division and Notch signaling pathway and promotes the proliferation and inhibits apoptosis of triple-negative breast cancer cells through survivin mediation.
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：2220776