【摘要】：背景和目的:食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,全球每一年大約有30萬人死于食管癌。我國作為食管癌的高發(fā)區(qū)之一,食管鱗狀細(xì)胞癌占所有病理類型的的百分之九十。隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究不斷深入,通過有效簡便的方法篩選鑒定腫瘤干細(xì)胞成為目前腫瘤干細(xì)胞研究的前提。近期有相關(guān)報(bào)道已經(jīng)鑒定了不同種類的實(shí)體瘤的腫瘤干細(xì)胞中的一種固有的自發(fā)熒光表型,運(yùn)用這種標(biāo)記物作為一種新穎和功能性的相關(guān)工具去分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞,特別的是在胰腺導(dǎo)管腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞癌中,可以運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)自發(fā)熒光細(xì)胞進(jìn)行跟蹤和分離。本研究根據(jù)這項(xiàng)新的方法將食管癌原代細(xì)胞進(jìn)行分離,并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)自發(fā)熒光細(xì)胞亞群在食管癌原代細(xì)胞中的表達(dá),并對(duì)其進(jìn)行篩選及初步鑒定,以豐富食管癌實(shí)體瘤干細(xì)胞篩選及鑒定的相關(guān)研究。材料和方法:收集2015年3月1日至2016年3月1日,于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行食管癌根治術(shù)的新鮮腫瘤組織標(biāo)本48例,組織病理類型均經(jīng)過三位病理專家鑒定為食管鱗狀細(xì)胞癌�；颊卟∈吠暾倚g(shù)前均未經(jīng)放化療等治療。首先運(yùn)用酶消化法進(jìn)行食管癌原代細(xì)胞的分離,然后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)自發(fā)熒光細(xì)胞亞群在食管癌原代細(xì)胞中的表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行篩選。最后通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)、MTT法測(cè)增值能力試驗(yàn)和成球試驗(yàn)來初步鑒定自發(fā)熒光細(xì)胞亞群具有腫瘤干細(xì)胞特性。結(jié)果:1.運(yùn)用酶消化法對(duì)食管癌原代細(xì)胞進(jìn)行分離,成功分離了能夠滿足后期實(shí)驗(yàn)的10例標(biāo)本,成功率達(dá)到20.8%(10/48)。2.運(yùn)用流式儀進(jìn)行分選,細(xì)胞自發(fā)熒光在488nm藍(lán)色激光激發(fā),通過530/40和580/30間交叉的濾光片接收熒光信號(hào)并進(jìn)行檢測(cè)分選。未添加核黃素組自發(fā)熒光細(xì)胞百分比約為0.325±0.077,添加30μM核黃素組自發(fā)熒光細(xì)胞百分比約為4.875±0.498,兩組之間t=9.013,P0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.通過添加不同濃度的核黃素觀察食管癌原代細(xì)胞中自發(fā)熒光細(xì)胞的百分比,發(fā)現(xiàn)自發(fā)熒光百分比和培養(yǎng)基核黃素濃度之間有很強(qiáng)的聯(lián)系,并證明了在核黃素濃度在30μM的自發(fā)熒光細(xì)胞亞群比例達(dá)到平衡。4.通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)其結(jié)果顯示:自發(fā)熒光細(xì)胞組克隆形成率是0.325±0.031,非自發(fā)熒光細(xì)胞組克隆形成率是0.083±0.015,兩組間克隆率有顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.106,P0.001)。5.通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)其結(jié)果顯示:自發(fā)熒光細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為136±5.51,非自發(fā)熒光細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為66±2.08,有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.89,P0.01)。在檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果顯示:自發(fā)熒光細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為45.33±1.45,非自發(fā)熒光細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為20±2.52,有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.718,P0.01)。6.通過MTT法測(cè)增值實(shí)驗(yàn)其結(jié)果顯示:自發(fā)熒光細(xì)胞組的增值能力顯著高于非自發(fā)熒光細(xì)胞組。在第一天兩組之間的增值能力沒有明顯差異,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在第二天到第七天兩組之間的增值能力差異顯著,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.通過細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)其結(jié)果顯示:觀察第1,3,7天的細(xì)胞變化情況,自發(fā)熒光細(xì)胞的成球能力明顯高于非自發(fā)熒光細(xì)胞。兩組細(xì)胞成球數(shù)差異有顯著性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.采用酶消化法可以成功對(duì)食管癌原代細(xì)胞進(jìn)行有效分離培養(yǎng)。2.運(yùn)用食管癌原代細(xì)胞中表達(dá)的自發(fā)熒光細(xì)胞表型,可以對(duì)原代食管癌細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞的篩選。3.食管癌自發(fā)熒光細(xì)胞亞群具有自我更新、高增值能力、高侵襲遷移能力的腫瘤干細(xì)胞生物特性。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE: Esophageal cancer is one of the most common malignant tumors of the digestive tract, and about 300,000 people die of esophageal cancer every year. As one of the high incidence areas of esophageal cancer, esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) accounts for 90% of all pathological types in China. Identification of cancer stem cells is a prerequisite for cancer stem cell research. Recent reports have identified an intrinsic autofluorescent phenotype in cancer stem cells from different types of solid tumors. The use of this marker as a novel and functional tool for isolating and identifying cancer stem cells, particularly in the context of cancer stem cell research. In pancreatic ductal adenocarcinoma, colon cancer, hepatocellular carcinoma and non-small cell carcinoma, autofluorescent cells can be tracked and isolated by flow cytometry. Materials and Methods: From March 1, 2015 to March 1, 2016, 48 fresh specimens of esophageal carcinoma were collected from thoracic surgery of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University. The histopathological types of the specimens were all specialized in three pathological types. Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) was identified by our laboratory. The patient had a complete history and had not been treated by radiotherapy or chemotherapy before operation. First, the primary cells of ESCC were isolated by enzymatic digestion, then the expression of autofluorescent cell subsets in ESCC was detected by flow cytometry and screened by plate cloning. Results: 1. The primary cells of esophageal cancer were separated by enzymatic digestion, and 10 specimens were successfully separated. The success rate was 20.8% (10/48). 2. The flow rate was used to isolate the primary cells of esophageal cancer. The percentage of spontaneous fluorescent cells in the non-riboflavin group was about 0.325 [0.077] and the percentage of spontaneous fluorescent cells in the riboflavin group was about 4.875 [0.498] and T = 9.0 between the two groups. 13, P 0.001, the difference was statistically significant. 4. The results of plate cloning experiment showed that the cloning rate of spontaneous fluorescent cells was 0.325 (+ 0.031) and that of non-spontaneous fluorescent cells was 0.083 (+ 0.015). There was a significant difference in the cloning rate between the two groups (t = 7.106, P 0.001). 5. The results of Transwell migration experiment showed that spontaneous fluorescent cells could form spontaneous fluorescent cells. The number of migrating cells was 136 [5.51] and that of non-spontaneous fluorescent cells was 66 [2.08]. There was significant difference between the two groups (t = 11.89, P 0.01). The results showed that the number of invasive cells of spontaneous fluorescent cells was 45.33 [1.45] and that of non-spontaneous fluorescent cells was 20 [2.52], which was significantly worse. The results of MTT assay showed that the proliferation ability of spontaneous fluorescent cells was significantly higher than that of non-spontaneous fluorescent cells. Spontaneous fluorescent cells were significantly higher than non-spontaneous fluorescent cells on the 1st, 3rd and 7th day of observation. There was a significant difference in the number of globules between the two groups, with statistical significance (P 0.05). Conclusion: 1. Enzymatic digestion can successfully eat food. Esophageal cancer primary cells can be effectively isolated and cultured. 2. Esophageal cancer primary cells can be screened by autofluorescent cell phenotype. 3. Esophageal cancer autofluorescent cell subsets have the biological characteristics of self-renewal, high proliferation, high invasion and migration.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2215463