發(fā)布時間：2018-08-27 14:01

【摘要】：第一部分 14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中表達及其與臨床預后的關系目的：檢測14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中的表達,明確二者間的相互關系,并進一步探討二者的表達與膽管癌臨床病理特征的相關性。方法：運用免疫組織化學(IHC)、實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和免疫印跡法(WB)的方法檢測64例臨床膽管癌患者的手術標本中14-3-3ξ、aPKC-ι和E-cadherin在癌組織與癌旁組織的差異表達,另外,取10例膽管囊腫組織做陰性對照�？ǚ綑z驗和t檢驗檢測14-3-3ξ和aPKC-ι與膽管癌病理分化和TNM分期的關系；Spearman相關性分析法分析二者之間相關性；Kaplan-Meier法計算二者的表達與膽管癌患者總體生存得關系；Cox多因素回歸分析分析膽管癌患者預后獨立影響因素。結果：在mRNA和蛋白質水平,14-3-3ξ在膽管癌組織中顯著高表達,在癌旁組織和癌旁組織呈低表達；14-3-3ξ和aPKC-ι在膽管癌組織中協(xié)同高表達,二者呈正相關,并且與E-cadherin表達相反；14-3-3ξ和aPKC-ι二者的高表達與膽管癌的病理分化和TNM分期密切相關,二者共同低表達的患者總體生存時間較共同高表達者或單一低表達者生存時間長,Cox多因素回歸分析14-3-3ξ是膽管癌預后的獨立影響因素。結論：14-3-3ξ和aPKC-ι協(xié)同促進膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移,14-3-3ξ是膽管癌預后的獨立影響因素,可作為預測膽管癌預后的指標。第二部分14-3-3ξ與aPKC-ι結合并相互調(diào)節(jié)目的：在第一部分研究基礎上進一步明確14-3-3ξ與aPKC-ι之間的相互關系.方法：通過CO-IP實驗初步檢測14-3-3ξ與aPKC-ι是否存在特異性的直接結合關系。并運用小分子干擾技術,合成14-3-3ζ-siRNA,aPKC-ι-siRNA和aPKC-ι過表達載體,構建穩(wěn)定的14-3-3ξ低表達.aPKC-ι氏表達和aPKC-ι高表達人膽管癌細胞系。通過qRT-PCR、WB和IF檢測靶向沉默14-3-3ξ或aPKC-ι以及aPKC-ι-siRNA拯救實驗中,相應aPKC-ι或14-3-3ξ的表達情況。結果：CO-IP結果提示,經(jīng)14-3-3ξ與aPKC-ι抗體沉淀的人膽管癌組織和細胞蛋白中,WB可檢測出相應的aPKC-ι和14-3-3ξ蛋白條帶；在體外,靶向沉默人膽管癌細胞中14-3-3ξ或aPKC-ι表達后,相應的出現(xiàn)aPKC-ι或14-3-3ξ表達下降現(xiàn)象；并且在aPKC-ι-siRNA拯救實驗中,伴隨著aPKC-ι表達恢復的同時,14-3-3ξ表達亦出現(xiàn)升高。結論：在人膽管癌中,14-3-3ξ與aPKC-ι存在特異性的直接結合關系,并且二者通過結合而互相調(diào)節(jié)。第三部分14-3-3ζ-aPKC-ι復合物促進膽管癌細胞上皮-間質細胞轉化目的：進一步探討14-3-3ξ對人膽管癌細胞EMT轉化的調(diào)控機制。方法：通過TGF-β1誘導構建人膽管癌細胞EMT體外模型,并運用小分子干擾技術和siRNA拯救實驗,靶向調(diào)控膽管癌14-3-3ξ和aPKC-ι的表達,通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變,以及qRT-PCR、WB和IF檢測EMT表型標志物。結果：通過TGF-β1誘導構建人膽管癌細胞EMT體外模型,檢測細胞形態(tài)學變化有短梭形或三角形以及多邊形變?yōu)榧氶L的纖維狀或長梭形；EMT標志物：上皮樣表型E-cadherin和β-catenin表達減少,而間質樣表型N-cadherin和Vimentin表達增多；以及transwell侵襲實驗檢測細胞EMT轉化后細胞侵襲移動能力增強。然后當靶向沉默人膽管癌細胞中14-3-3ξ或aPKC-ι的表達, TGF-β1刺激引起轉變?yōu)榧氶L的纖維狀或長梭形的細胞數(shù)目減少,EMT標志物無明顯變化。另外,aPKC-ι-siRNA拯救實驗提示,伴隨aPKC-ι的表達恢復,14-3-3ξ的表達亦得以升高,同時EMT標志物的變化再次出現(xiàn)典型的EMT轉化表型標志物變化。結論：在體外,14-3-3ξ通過與aPKC-ι結合形成復合物,促進人膽管癌細胞EMT轉化。第四部分靶向沉默14-3-3ξ在體內(nèi)外抑制膽管癌侵襲轉移及增殖目的：通過體外、體內(nèi)實驗驗證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌增殖和轉移的作用。方法：通過Transwell侵襲實驗、劃痕實驗和克隆平板實驗體外驗證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌細胞的增殖和轉移作用；通過裸鼠皮下移植瘤實驗、肺轉移模型的構建,并且皮下移植瘤和肺轉移瘤行HE染色、IHC染色檢測,以及皮下移植瘤行qRT-PCR和WB檢測,體內(nèi)驗證靶向沉默14-3-3ξ對膽管癌細胞的增殖和轉移作用。結果：在體外,靶向沉默14-3-3ξ后,Transwell侵襲試驗中膽管癌細胞穿透基底膜的細胞數(shù)目減少；劃痕實驗中細胞移動的速率下降；克隆平板實驗中細胞克隆數(shù)目減少。在體內(nèi),靶向沉默14-3-3ξ后,皮下移植瘤成瘤能力顯著下降；而肺轉移瘤的數(shù)目亦顯著減少；經(jīng)IHC、qRT-PCR和WB檢測證實實驗組中14-3-3ξ和aPKC-ι的表達下降。結論：在體內(nèi)、外靶向沉默14-3-3ξ能抑制膽管癌細胞的侵襲轉移和增殖,有可能成為膽管癌治療的新靶點。
[Abstract]:Objective: To detect the expression of 14-3-3x2 and aPKC-_in cholangiocarcinoma and their relationship with clinical prognosis. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and immunoblotting (WB) were used to detect the differential expression of 14-3-3, aPKC-_and E-cadherin in the tumor tissues and adjacent tissues of 64 patients with cholangiocarcinoma. In addition, 10 cases of cholangiocyst tissues were taken as negative control. Chi-square test and t-test were used to detect 14-3-3 and aPKC-_and cholangiocarcinoma. Correlation between pathological differentiation and TNM staging was analyzed by Spearman correlation analysis; Kaplan-Meier method was used to calculate the relationship between their expression and overall survival of patients with cholangiocarcinoma; Cox multivariate regression analysis was used to analyze independent prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma. The expression of 14-3-3x2 and aPKC-_was positively correlated with the expression of E-cadherin, while the expression of 14-3-3x2 and aPKC-_was correlated with the pathological differentiation and TNM stage of cholangiocarcinoma. Cox multivariate regression analysis showed that 14-3-3_was an independent predictor of the prognosis of cholangiocarcinoma. Conclusion: 14-3-3_and aPKC-_co-promoted the occurrence, development, invasion and metastasis of cholangiocarcinoma, and 14-3-3_was an independent predictor of the prognosis of cholangiocarcinoma. The second part, 14-3-3 zeta and aPKC-_binding and mutual regulation purposes: Based on the first part of the study to further clarify the relationship between 14-3-3 zeta and aPKC-_. Methods: CO-IP experiment was used to detect whether 14-3-3 zeta and aPKC-_had specific direct binding relationship. Small molecule interference technology was used to synthesize 14-3-3 zeta. 3_-siRNA, aPKC-_-siRNA and aPKC-_overexpression vectors were constructed to construct stable 14-3-3_low expression vectors. The expression of aPKC-_and aPKC-_high expression human cholangiocarcinoma cell lines. Targeted silencing 14-3-3_or aPKC-_or aPKC-_-siRNA rescue experiments were performed by qRT-PCR, WB and IF detection. The results suggested that the expression of aPKC-_or 14-3-CO-IP 3_in the corresponding aPKC-_or aPKC-siRNA rescue experiments. WB could detect the corresponding aPKC-_and 14-3-3_protein bands in human cholangiocarcinoma tissues and cell proteins precipitated by 14-3-3_and aPKC-_antibodies; in vitro, the expression of aPKC-_or 14-3-3_decreased after targeted silencing of 14-3-3_or aPKC-_expression in human cholangiocarcinoma cells; and in aPKC-_-siRNA rescue experiment, the expression of aPKC-_-siRNA was accompanied by the decrease of aPKC-_-3-3 The expression of aPKC-_was restored and the expression of 14-3-3 was also elevated. Conclusion: 14-3-3 and aPKC-_were specifically and directly bound to each other in human cholangiocarcinoma. Part 3 14-3-3_-aPKC-_complex promotes epithelial-stromal cell transformation of cholangiocarcinoma cells METHODS: Human cholangiocarcinoma cell EMT model was established by TGF-beta 1 induction, and the expression of 14-3-3 ZE and aPKC-_in cholangiocarcinoma was regulated by small molecule interference technique and siRNA rescue experiment. The morphological changes of cells were observed by microscope, and the phenotype of EMT was detected by qRT-PCR, WB and IF. OBJECTIVE. RESULTS: EMT model of human cholangiocarcinoma cells induced by TGF-beta 1 was established in vitro. The morphological changes of the cells were observed as short spindle or triangle and polygonal shape as slender fibrous or long spindle. EMT markers: epithelioid phenotype E-cadherin and beta-catenin expression decreased, while mesenchymal phenotype N-cadherin and Vimentin expression increased. Then, when the expression of 14-3-3x2 or aPKC-_in human cholangiocarcinoma cells was silenced, the number of cells transformed into slender fibrous or long spindle shape was reduced by TGF-beta 1 stimulation, and the EMT markers did not change significantly. The results showed that the expression of 14-3-3 Zeta increased with the recovery of aPKC-_expression, and the changes of EMT markers appeared again. Conclusion: 14-3-3 Zeta promotes EMT transformation of human cholangiocarcinoma cells in vitro and in vivo by binding to aPKC-_to form a complex. Objective: To verify the effect of targeted silencing 14-3-3x2 on the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Methods: Transwell invasion test, scratch test and clone plate test were used to verify the effect of targeted silencing 14-3-3x2 on the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma cells in vitro and subcutaneous transplantation of tumor in nude mice. In vivo, the proliferation and metastasis of cholangiocarcinoma cells were tested by targeting silencing 14-3-3x2. Results: In vitro, after targeting silencing 14-3-3x2, cholangiocarcinoma cells penetrated in the Transwell invasion test. The number of transbasement membrane cells decreased; the rate of cell migration decreased in scratch test; and the number of cell clones decreased in clone plate test. Conclusion: Targeted silencing of 14-3-3_in vitro can inhibit the invasion, metastasis and proliferation of cholangiocarcinoma cells, and may become a new target for the treatment of cholangiocarcinoma.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 孟興凱,楊成旺;膽管癌的診斷及治療進展[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學院學報;2002年02期

2 李蓉,蔡中起,張靜;膽管癌診治進展[J];臨床肝膽病雜志;2002年04期

3 黎靖,馮春紅,張旭,雷正明;膽管癌病理誤診一例[J];中華肝膽外科雜志;2003年09期

4 吳高松,羅先文,吳劍宏,鄒聲泉,裘法祖;先天性膽總管囊腫膽汁對膽管癌細胞系的作用[J];中華消化雜志;2004年01期

5 孔琦,黃強;膽管癌分子生物學研究進展[J];肝膽外科雜志;2004年05期

6 彭創(chuàng);湯恢煥;;膽管癌的分子生物學進展[J];國際病理科學與臨床雜志;2007年02期

7 李惠珍;Aqeel ahmed;傅華群;;膽管癌的早期診斷[J];江西醫(yī)藥;2008年12期

8 王健東;全志偉;;膽管癌基礎研究現(xiàn)狀[J];中國實用外科雜志;2008年04期

9 鄒聲泉;鄭順貞;;膽管癌分子生物學的研究現(xiàn)狀及其意義[J];腹部外科;2008年02期

10 顧勁揚;仇毓東;周建新;丁義濤;;膽管癌發(fā)病機制及治療進展[J];肝膽外科雜志;2010年05期

相關會議論文 前10條

1 周娉婷;房萌;高春芳;;膽管癌N糖標志物發(fā)現(xiàn)及其機制研究[A];第一次全國中西醫(yī)結合檢驗醫(yī)學學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

2 張豐深;馬寬生;何振平;董家鴻;;細胞凋亡相關基因與膽管癌臨床病理的關系[A];2001'全國腫瘤外科學術會議論文匯編[C];2001年

3 張豐深;馬寬生;何振平;董家鴻;;CCK、Gastrin對bcl-2基因家族的調(diào)節(jié)作用[A];2001'全國腫瘤外科學術會議論文匯編[C];2001年

4 余建華;崔云甫;;膽管癌發(fā)病機制研究進展[A];中國抗癌協(xié)會膽道腫瘤專業(yè)委員會成立大會暨第一屆全國膽道腫瘤學術會議論文集[C];2009年

5 張豐深;馬寬生;何振平;董家鴻;;CCK,Gastrin對凋亡基因的調(diào)節(jié)作用[A];第七屆全國腫瘤生物治療學術會議論文集[C];2001年

6 馬寬生;張豐深;何振平;董家鴻;;CCK,Gastrin對膽管癌細胞凋亡的作用[A];第七屆全國腫瘤生物治療學術會議論文集[C];2001年

7 韓鵬;邱乒乒;戴燕燕;練惠輝;李文崗;陳清西;;河蜆活性物質對肝癌、膽管癌細胞生長的影響[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

8 李薇;曾祥元;李昆;;膽管癌QBC939細胞株對人臍靜脈內(nèi)皮細胞VEGF和b-FGF表達的影響[A];中國微循環(huán)學會2014年全國學術會議大會匯編[C];2014年

9 張昆松;梁力建;殷曉煜;;Wnt通路相關因子在膽管癌細胞系中的表達及其siRNA干擾實驗[A];中國抗癌協(xié)會膽道腫瘤專業(yè)委員會成立大會暨第一屆全國膽道腫瘤學術會議論文集[C];2009年

10 馬寬生;張豐深;何振平;董家鴻;;CCK、Gastrin在beauvericin誘導膽管癌細胞凋亡中的作用[A];2001'全國腫瘤外科學術會議論文匯編[C];2001年

相關重要報紙文章 前2條

1 陳漢橋;大連醫(yī)科大學附屬一院膽管癌基因治療研究獲重要進展[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 陳漢橋;基因治膽管癌研究有進展[N];健康報;2006年

相關博士學位論文 前10條

1 楊輝;FBXW7抑制膽管癌上皮—間質轉化、干細胞特性及轉移的作用及機制研究[D];山東大學;2016年

2 戚大川;應用基因芯片篩選膽管癌相關差異表達基因及對其功能的研究[D];蘇州大學;2015年

3 高云姝;PRR11在消化道腫瘤中的表達變化及其在膽管癌中的作用機制[D];青島大學;2016年

4 趙鑫;B7-H4在膽管癌免疫逃逸中的作用和臨床意義的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

5 李勇;CDC42過表達在膽管癌侵襲轉移機制中的作用實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

6 劉顏;aPKC-ι調(diào)控膽管癌細胞EMT及化療抵抗作用中的機制研究[D];華中科技大學;2015年

7 楊彥;14-3-3ζ結合aPKC-ι經(jīng)上皮—間質細胞轉化促進膽管癌侵襲轉移[D];華中科技大學;2015年

8 韓鵬;膽管癌藥物的篩選及作用機理的研究[D];廈門大學;2009年

9 陳紹勤;膽管癌蛋白組學研究[D];華中科技大學;2009年

10 錢振宇;膽管癌與乙型和丙型肝炎病毒感染的相關性研究[D];復旦大學;2003年

相關碩士學位論文 前10條

1 董陽民;SENP1對膽管癌細胞增殖與徖移能力的影響以及SENP1在膽管癌標本中的表達情況[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 樸鶴云;矢車菊素-3-葡萄糖苷對人膽管癌QBC939細胞的影響[D];延邊大學;2015年

3 李志鋒;骨橋蛋白與CD44v6在膽管癌中的表達及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 黃朝君;γ-氨基丁酸在膽管癌細胞中的作用機制及相關效應基因的探討[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

5 薛立新;Hedgehog信號轉導通路在膽管癌中作用機制初步研究[D];瀘州醫(yī)學院;2011年

6 趙殿堂;siRNA沉默Wip1基因對人膽管癌QBC939細胞的影響[D];山東大學;2015年

7 劉暢;醛酮還原酶家族1的C1亞型在膽管癌發(fā)生發(fā)展中作用及機制[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

8 周娉婷;惡性膽胰腫瘤N糖組標志物和相關機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

9 路健;煙堿型乙酰膽堿α7受體對膽管癌神經(jīng)浸潤的影響[D];青島大學;2015年

10 譚永輝;ErbB4在膽管癌中的表達變化及作用研究[D];湖南師范大學;2015年

，

本文編號：2207506