【摘要】：PHF8屬于組蛋白去甲基化家族成員,在腦部發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育的過程中起到重要作用;同時(shí)PHF8還能參與多種病理過程,包括X染色體連鎖智力發(fā)育遲緩和腫瘤發(fā)生。但是PHF8自身的異常調(diào)控以及PHF8在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制尚不明確。在該研究中我們我們通過體內(nèi)外的去泛素化實(shí)驗(yàn)闡明了USP7通過其去泛素化酶活性去除PHF8的泛素基團(tuán),從而穩(wěn)定PHF8。接下來,我們運(yùn)用RNA-seq技術(shù)篩選出兩者共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄的靶基因cyclin A2,通過免疫組化、細(xì)胞及動(dòng)物模型的表型實(shí)驗(yàn),證實(shí)了PHF8/USP7通過上調(diào)cyclin A2的轉(zhuǎn)錄從而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)在DNA損傷時(shí),PHF8與USP7的相互作用有所加強(qiáng);USP7介導(dǎo)的PHF8穩(wěn)定性調(diào)節(jié)可以通過促進(jìn)細(xì)胞的雙鏈損傷修復(fù)使細(xì)胞抵抗DNA損傷。目的探索PHF8自身異常調(diào)控以及PHF8在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制。結(jié)果：1、PHF8與USP7具有直接相互作用。通過免疫親和純化與質(zhì)譜分析鑒定出了與PHF8有相互作用的蛋白質(zhì)去泛素化酶USP7,并且運(yùn)用免疫共沉淀和昆蟲細(xì)胞純化蛋白在體內(nèi)、體外驗(yàn)證了它們存在直接相互作;PHF8的C端不含明顯結(jié)構(gòu)域的部分與USP7的N端的MATH結(jié)構(gòu)域?yàn)槎呦嗷プ饔盟蕾嚨慕Y(jié)構(gòu)域。2、USP7通過去泛素化酶活性特異性地穩(wěn)定PHF8蛋白水平。USP7能夠通過相互作用與PHF8結(jié)合,再通過其自身去泛素化酶活性,催化去除PHF8上多聚泛素鏈,抑制PHF8通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。3、USP7/PHF8調(diào)控軸能夠正向激活cyclin A2信號(hào)通路。PHF8和USP7能夠共同激活多個(gè)下游靶基因,這些靶基因在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等通路中發(fā)揮重要作用。其中,cyclin A2是USP7和PHF8共同的下游靶基因,USP7和PHF8能夠正向調(diào)控CCNA2勺轉(zhuǎn)錄;PHF8能夠直接結(jié)合在CCNA2的啟動(dòng)子區(qū)域;USP7則通過PHF8間接調(diào)節(jié)CCNA2的轉(zhuǎn)錄。4、PHF8能夠調(diào)節(jié)USP7的轉(zhuǎn)錄,兩者形成正反饋循環(huán)。USP7同時(shí)也是PHF8的下游靶基因,能夠受到PHF8的正向調(diào)節(jié)。兩者形成正反饋的回路：一方面,USP7在蛋白水平上穩(wěn)定PHF8的蛋白水平;另一方面,PHF8又可以調(diào)節(jié)USP7的mRNA水平,促進(jìn)USP7的轉(zhuǎn)錄。兩者相互依存,相互影響,相互促進(jìn)。5、USP7/PHF8調(diào)控軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與腫瘤生長。USP7通過去泛素化PHF8上調(diào)cyclin A2的表達(dá);該效應(yīng)在體外促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長與增殖,在體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。6、USP7和PHF8在多種腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào),并與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)。USP7和PHF8的蛋白及mRNA水平在乳腺中高表達(dá),并且與乳腺癌的臨床分級(jí)呈正相關(guān)在這些樣本中,USP7和PHF8的表達(dá)水平與cyclin A2也呈現(xiàn)正相關(guān)。7、在DNA損傷反應(yīng)應(yīng)答中,USP7介導(dǎo)的PHF8穩(wěn)定性調(diào)節(jié)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗DNA損傷。在DNA雙鏈損傷發(fā)生時(shí),USP7能夠通過加強(qiáng)與PHF8的相互作用和增強(qiáng)去除PHF8多聚泛素鏈,進(jìn)而增強(qiáng)同源重組修復(fù)(HR)和非同源重組末端鏈接(NHEJ)的修復(fù)效率,提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷的耐受能力。結(jié)論：綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)PHF8與USP7在體內(nèi)、體外有特異的相互作用。USP7能夠通過其自身的去泛素化酶活性特異性地穩(wěn)定PHF8的蛋白水平,抑制PHF8通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。USP7介導(dǎo)的PHF8蛋白的穩(wěn)定性能激活cyclin A2信號(hào)通路,從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長和增殖能力。PHF8也能調(diào)控USP7的轉(zhuǎn)錄活性,正向介導(dǎo)USP7的轉(zhuǎn)錄,與USP7形成正反饋回路。在組織樣本分析中,我們發(fā)現(xiàn)USP7/PHF8/cyclin A2在多種腫瘤中高表達(dá),與乳腺癌的惡性程度分級(jí)呈正相關(guān)。最后,在DNA損傷反應(yīng)應(yīng)答中,USP7和PHF8的相互作用和功能有所增強(qiáng),并通過增強(qiáng)HR和NHEJ的修復(fù)效率提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗DNA損傷能力。
[Abstract]:PHF8 is a member of the histone demethylation family and plays an important role in brain development and neurodevelopment. PHF8 is also involved in a variety of pathological processes, including X-linked mental retardation and tumorigenesis. In this study, we demonstrated that USP7 can stabilize PHF8 by removing the ubiquitin group of PHF8 through its activity of ubiquitination enzymes in vivo and in vitro. Next, we used RNA-seq technology to screen the target gene cyclin A2 which co-regulates transcription. Through immunohistochemistry, cell and animal model phenotypic experiments, we identified the two genes. It is confirmed that PHF8/USP7 can affect the proliferation of breast cancer cells by up-regulating the transcription of cyclin A2. Further, we found that the interaction between PHF8 and USP7 was enhanced during DNA damage. USP7-mediated regulation of PHF8 stability can make cells resist DNA damage by promoting the repair of double-strand damage. Results: 1. PHF8 interacted with USP7 directly. Protein deubiquitinase USP7 interacting with PHF8 was identified by immunoaffinity purification and mass spectrometry analysis, and their existence was verified in vitro by immunoprecipitation and insect cell purification in vivo. The MATH domain of the N-terminal of USP7 and the C-terminal of PHF8 are dependent on the interaction of the two domains. 2. USP7 stabilizes the level of PHF8 protein specifically by the activity of deubiquitinase. USP7 can bind to PHF8 through the interaction and catalyze the removal of PHF8 by its own deubiquitinase activity. Polyubiquitin chains inhibit the degradation of PHF8 via ubiquitin-proteasome pathway. 3. USP7/PHF8 regulatory axis can activate cyclin A2 signaling pathway. PHF8 and USP7 can activate multiple downstream target genes, which play an important role in cell cycle, DNA replication and other pathways. Target genes, USP7 and PHF8 can positively regulate CCNA2 spoon transcription; PHF8 can directly bind to the promoter region of CCNA2; USP7 can indirectly regulate CCNA2 transcription through PHF8; and PHF8 can regulate the transcription of USP7 and form a positive feedback loop. USP7 is also a downstream target gene of PHF8 and can be positively regulated by PHF8. The pathway: on the one hand, USP7 stabilizes the protein level of PHF8 at the protein level; on the other hand, PHF8 regulates the mRNA level of USP7 and promotes the transcription of USP7. They are interdependent and mutually reinforcing. 5. USP7/PHF8 axis promotes the proliferation and tumor growth of breast cancer cells. USP7 upregulates cyclin A2 expression through deubiquitination of PHF8. The expression of USP7 and PHF8 was up-regulated in various tumor tissues and positively correlated with the malignant degree of breast cancer. The protein and mRNA levels of USP7 and PHF8 were highly expressed in breast and positively correlated with the clinical grading of breast cancer. The expression levels of USP7 and PHF8 were also positively correlated with cyclin A2 in these samples. In DNA damage response, USP7-mediated regulation of PHF8 stability could promote breast cancer cells to resist DNA damage. To enhance the repair efficiency of homologous recombinant repair (HR) and non-homologous recombinant end-linking (NHEJ) and enhance the tolerance of breast cancer cells to DNA damage. Conclusion: In summary, this study found that PHF8 and USP7 have specific interactions in vivo and in vitro. USP7 can specifically stabilize PHF8 protein through its own ubiquitin-depleting enzyme activity. The stability of PHF8 protein mediated by USP7 can activate cyclin A2 signaling pathway, thereby promoting the growth and proliferation of breast cancer cells. PHF8 can also regulate the transcriptional activity of USP7, mediate the transcription of USP7, and form a positive feedback loop with USP7. It was found that USP7/PHF8/cyclin A2 was highly expressed in various tumors and was positively correlated with the malignant grade of breast cancer. Finally, in DNA damage response, the interaction and function of USP7 and PHF8 were enhanced, and the ability of breast cancer cells to resist DNA damage was enhanced by enhancing the repair efficiency of HR and NHEJ.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2204336