【摘要】：砷屬于半金屬元素(Semimetal),廣泛分布在世界各地,在所有元素中位列第二十。當前,全球砷污染的地下水面積不斷擴大,引起了一系列嚴重公眾問題,因而大家對于砷的關注點主要集中在環(huán)境方面。根據(jù)流行病調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),砷污染的飲用水可能會導致一系列疾病的發(fā)生,例如皮膚角化病,乏力,嘔吐,神經(jīng)病變和癌變等。目前,砷被美國環(huán)境保護署(EPA)認定為是致癌物,他們指出長期慢性暴露砷會引起膀胱、肺、肝和皮膚癌。砷除了具有致癌作用,還能導致多種毒性疾病如周圍血管疾病,黑腳以及高血壓。因此,美國環(huán)保署(EPA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)等多個組織規(guī)定飲用水中的砷濃度不得超出10pg/L。然而,全球多個國家仍然利用砷生產(chǎn)合金,農(nóng)藥和獸藥,環(huán)境污染的趨勢也在增加。砷在自然界主要以兩種形態(tài)存在(即有機和無機的形態(tài)存在于土壤和水中),而且砷的價態(tài)主要有三價和五價之分。研究發(fā)現(xiàn),三價砷的毒性要高于五價砷,其細胞毒性主要取決于細胞攝取砷的含量和積累。研究發(fā)現(xiàn),哺乳類來源的細胞攝取三價砷主要依靠水通道蛋白例如AQP3、7和9通道。而在紅細胞和血腦屏障上皮細胞葡萄糖轉運體GLUT1參與三價砷的攝取。因此,動物和人攝取三價無機砷的能力要遠大于五價無機砷,而產(chǎn)生三價無機砷細胞的毒性強于五價砷。還有,研究發(fā)現(xiàn)五價的iAsV主要通過磷酸鹽轉運體被細胞吸收,尤其在哺乳生物體內(nèi),iAsV主要通過Npt2轉運體(是一種磷酸鹽轉運體)進入細胞。但是目前也有研究這對此研究成果持有不同的觀點。關于砷的體內(nèi)代謝機制,研究證實砷在體內(nèi)與蛋白質(zhì)(巰基)結合,進而迅速被甲基化。尤其肝臟是砷甲基化的主要器官,iAsⅢ在砷甲基化轉移酶(AS3MT)的催化下,產(chǎn)生不同的甲基化代謝產(chǎn)物；這些砷甲基化代謝產(chǎn)物包括單甲基化代謝產(chǎn)物和二甲基化代謝產(chǎn)物。體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)三價的甲基化代謝中間產(chǎn)物主要包括MMAIⅢ, DMAⅢ,而五價的甲基化代謝產(chǎn)物主要包括MMAV和DMAV。目前為止,關于無機砷的體內(nèi)代謝途徑仍然不是很明晰。已知的第一種比較經(jīng)典的代謝途徑(1945年,Challenger提出)是無機砷通過氧化還原過程來進行甲基化代謝。在這條途徑中,三價的無機砷首先被氧化甲基化形成MMAV,進而MMAV還原成MMAⅢ。之后,MMAⅢ又會被氧化甲基化成DMAV,最終又被還原為DMAⅢ(此學說認為五價的MMAV和DMAV是中間代謝產(chǎn)物)。但是,最近的實驗研究發(fā)現(xiàn),當實驗動物被五價的無機砷(iAsV)處理后,很少有甲基化的代謝產(chǎn)物(即MMAV和DMAV)生成,這表明在無機砷的生物甲基化過程中,MMAV和DMAV可能是最終產(chǎn)物,而非中間產(chǎn)物。也有研究表明,他們在體內(nèi)組織中檢測不到游離的三價甲基化砷化合物MMAⅢ和DMAⅢ,卻發(fā)現(xiàn)其以蛋白結合的形態(tài)存在。因此,暗示三價的甲基化砷化合物可能是無機砷的中間代謝產(chǎn)物。但是,到目前為止沒有體內(nèi)實驗能夠證明MMAV和DMAV是無機砷的體內(nèi)中間代謝產(chǎn)物,而多項結果顯示五價的砷化合物是砷的最終代謝產(chǎn)物。2005年,日本的平野科研組提出無機砷的第二種代謝途徑。他們認為無機砷發(fā)生甲基化反應不通過氧化反應。在第二種新代謝途徑中,無機砷主要與谷胱甘肽形成復合體,而此復合體被認為是AS3MT的主要底物。通過與AS3MT相互作用,三價的無機砷谷胱甘肽復合體iAs(GS)3能夠被甲基化為M MA(GS)2和DMA(GS)。與第一條代謝途徑不同的是,發(fā)生甲基化反應時,砷不通過氧化反應進行甲基化反應,甲基化后的三價砷化合物可以氧化為五價的砷化合物。但是,第二條途徑?jīng)]有說明無機砷在甲基化代謝過程是與GSH或AS3MT蛋白相結合。2006年,我們提出了第三種無機砷代謝途徑。無機砷是通過與體內(nèi)富含半胱氨酰殘基的蛋白相結合,從而進行一系列甲基化反應,生成一甲基化產(chǎn)物(MMAⅢ)和二甲基化產(chǎn)物(DMAⅢ)。該條涂釋表明無機砷在體內(nèi)是通過三價的形態(tài)與蛋白相結合,之后在SAM和GSH的存在下,被AS3MT甲基化為MMAⅢ和DMAⅢ。無機砷在體內(nèi)的代謝過程被認為是減毒過程,因為在實驗動物尿液中發(fā)現(xiàn)了五價的甲基化代謝產(chǎn)物。但是,之后在動物和APL病人的尿液中發(fā)現(xiàn)了三價的甲基化代謝產(chǎn)物和硫化的砷劑,這引起大家對無機砷的體內(nèi)代謝轉化的更多關注。因此,為了闡明無機砷的體內(nèi)毒性和臨床治療分子機制,有必要深入研究無機砷在體內(nèi)的轉換、代謝及與蛋白的相互作用。雖然砷具有毒性和致癌性,但它也被認為是一種很好的抗癌藥,這體現(xiàn)出這種半金屬的矛盾性質(zhì),驅(qū)使我們?nèi)ヌ骄坎煌榛衔锏亩拘詸C制。與此同時,我們也討論了砷的細胞攝取、蓄積、排泄以及不同形態(tài)砷與蛋白質(zhì)的親和力,這些都與砷的毒性或治療效應密切相關。眾所周知,砷(三氧化二砷)作為一種有效的抗癌藥物,主要用于治療急性早幼粒細胞白血病(APL)。目前認為,三氧化二砷能夠誘導APL細胞分化為正常細胞,其主要機理是三氧化二砷能夠靶向降解APL細胞內(nèi)的PML-RARα的融合蛋白。最近,三氧化二砷也被用于治療APL以外的血液學惡性腫瘤,但是確切的抗癌機制還有待闡明。因此,砷的毒性和治療效果的不同機制還需要更深層次的研究。在本論文中,我們詳細討論了對于砷的致癌性和抗癌功效的機理的見解,進一步解釋了砷的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的多種細胞靶點及其誘導細胞凋亡的分子機制。此外,我們探討了砷化合物的現(xiàn)在和將來,并深入探討了砷作為抗癌藥物的歷程及存在的不足等。在隨后的章節(jié)中,我們進一步討論了三氧化二砷作為緩解APL的一線藥物的使用情況及對APL緩解和復發(fā)治療的效果。此外,還分析了三氧化二砷及其有機砷化合物對非APL腫瘤的治療效果,尤其重點探討了單用砷劑或合用其它抗癌藥物治療不同實體瘤的效果、優(yōu)點及進一步需要強化的方面。最后,我們詳細地總結了砷化合物的抗癌分子機制(例如探討單用砷劑或與其它化合物合用)。最近的研究發(fā)現(xiàn),細胞對砷的敏感性與轉運機制有關,這里我們也強調(diào)了砷的攝取和轉運途徑與其在細胞內(nèi)的蓄積和與蛋白質(zhì)的巰基結合有關。早在19世紀,砷曾作為強有力的藥物被用于治療不同的疾病,包括皮膚和乳腺癌、高血壓、胃潰瘍、風濕、梅毒、牛皮癬、痔瘡,甚至是中藥牙醫(yī)中的牙齒填充。然而,1992年至1999年間,三氧化二砷中藥制劑(俗稱‘"Ailing-1",含有1%的As203)首次被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗白血病的功效。尤其是,APL病人在三氧化二砷治療后顯示出較好的臨床效果,表現(xiàn)出令人難以置信的臨床緩解率和較低的毒性。2000年,美國FDA批準三氧化二砷用于APL的治療。APL的發(fā)生機制已被闡明,即15號染色體上的早幼粒細胞白血病(PML)基因和17號染色體上的視黃酸受體α (RARa)基因融合形成嵌合基因,表達PML-RARa融合癌蛋白,此融合蛋白阻礙了早幼粒細胞的成熟,導致APL的發(fā)生。關于APL的治療,目前已證實,高劑量的全反式維甲酸(ATRA)可誘導APL細胞分化。雖然ATRA顯示出卓越的誘導細胞分化的能力,但是在病人進行ATRA緩解治療后超過三到五周,疾病容易復發(fā)。因此,ATRA需要和其它化療藥物聯(lián)合使用。同樣,研究發(fā)現(xiàn)后天獲得ATRA抗性的APL患者不能第二次單用全反式維甲酸來治療。研究顯示,三氧化二砷對使用ATRA治療復發(fā)的APL患者具有很好的療效。關于砷劑治療白血病的分子機制研究,報道指出三氧化二砷對PML的半胱氨酸殘基有著高親和力,這可能導致PML-RARa融合蛋白的構象發(fā)生變化,最終導致該蛋白的降解。報道認為,三氧化二砷可直接與核質(zhì)PML及核小體中PML-RARa的PML的鋅指區(qū)域結合,形成PML-RARa多聚體,或通過使PML-RARa融合蛋白的PML之間形成二硫鍵進而重組PML-NBS。在此基礎上,PML-RARa多聚體通過與泛素結合酶9(UBC9)結合,發(fā)生SUMO化,然后經(jīng)環(huán)指蛋白4(RNF4)誘導,進行泛素化,導致其蛋白酶體依賴性降解,最后使得APL細胞分化為正常細胞。此外,三氧化二砷也被用于治療APL之外的惡性腫瘤或?qū)嶓w瘤。然而,三氧化二砷對實體瘤并沒有很好的抗腫瘤效果。但是,三氧化二砷與其他化療藥物的聯(lián)合治療策略對除了少數(shù)腫瘤之外的其他腫瘤顯露出可喜的成果。研究還發(fā)現(xiàn),當AS203注射到APL患者后,體內(nèi)發(fā)生甲基化,生成三價的中間代謝產(chǎn)物,然而,這些甲基化代謝物在治療白血病過程中究竟起到了什么樣的作用,至今沒有任何報道和研究。目前大多數(shù)研究人員很少注意三價中間代謝物在治療功效上的貢獻。一般來講,As203注射后會水解成iAsⅢ,然后代謝成甲基化的三價中間代謝產(chǎn)物(如MMAⅢ和DMAⅢ)。與五價的甲基化代謝物相比,三價砷化合物被認為具有較大的毒性。許多研究已經(jīng)證實,三價甲基化砷被發(fā)現(xiàn)可以容易地被吸收并聚集在細胞中,并進一步與各種關鍵酶或細胞器的半胱氨酸殘基相互作用且抑制其活性,最終導致砷毒性。甲基化代謝產(chǎn)物MMAⅢ和DMAⅢ可能影響各種細胞途徑,目前已發(fā)現(xiàn)其對不同細胞有著不同程度的影響,表明這兩種三價甲基化砷代謝產(chǎn)物對細胞有著不同的毒性作用。關于無機砷的細胞毒性,目前有多種解釋,其中比較受關注的是無機砷通過與生物大分子相結合來引起細胞毒性,長期可能引起人體細胞發(fā)生癌變。無機砷在引起細胞毒性的同時會激活一系列磷酸化依賴的信號途徑。在本論文中,我們探討了砷化合物對蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的影響研究。眾所周知,PTP可以通過調(diào)節(jié)酪氨酸受體水平來調(diào)節(jié)磷酸化依賴的信號通路。所以,我們希望能夠發(fā)現(xiàn)iAsⅢ及其中間代謝產(chǎn)物與PTP之間的關系。我們的實驗結果表明,三價砷的中間代謝產(chǎn)物能夠強烈抑制PTP1B和CD45的活性,但是無機砷卻不能。我們的研究結果顯示,甲基化砷可能通過PTP失活來干擾正常的細胞信號通路(詳細內(nèi)容參照正文)。另外,我們比較了三價砷(包括iAsⅢ、MMAⅢ、DMAⅢ)抗白血病的活性及其作用機制。此課題以人粒細胞白血病HL-60細胞系為主要研究對象。為了研究可能參與誘導HL-60細胞毒性的砷化物的靶點,我們用相同濃度的三種砷化合物分別處理細胞,檢測了活性氧的生成情況和DNA的損傷程度等誘導細胞凋亡的分子機制。本實驗中,三價的砷代謝產(chǎn)物MMAⅢ和DMAⅢ分別通過用L-半胱氨酸在90攝氏度還原五價的MMAV和DMAV制備。細胞存活率用MTT法測定。細胞攝取砷含量通過ICP質(zhì)譜進行測定。Western blot法用來檢測HL-60細胞中Caspase-9,Caspase-3和PARP等蛋白的表達。Caspase-3的特異性底物(AC-DEVD-pNA)用來測量細胞內(nèi)Caspase-3的活性。細胞凋亡率通過流式細胞儀結合Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色來檢測。結果顯示,三價的甲基化代謝產(chǎn)物(即MMAⅢ和DMAⅢ)具有較強的細胞毒性,其毒性強于無機砷(iAsⅢ)。MTT結果表明,iAsⅢ的IC50值大約為10μM,然而,MMAⅢ和DMAⅢ在較低濃度(分別為3和2μM)顯著抑制了細胞增殖。較低劑量的MMAⅢ和DMAⅢ也能顯著誘導細胞凋亡。為了觀察MMAⅢ和DMAⅢ是否能通過誘導凋亡從而誘導細胞死亡,我們使用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色檢測HL-60細胞的凋亡率。結果顯示,MMAⅢ和DMAⅢ顯著誘導HL-60細胞凋亡。此外,NAC預處理HL-60細胞后,MMAⅢ和DMAⅢ誘導的凋亡被有效抑制,這表明ROS產(chǎn)生可能是MMAⅢ和DMAⅢ誘導HL-60細胞凋亡的主要原因。此外,western blot結果顯示,HL-60細胞在MMAⅢ和DMAⅢ處理后,caspase-3和caspase-9有明顯的上調(diào),并且,PARP也有明顯的裂解片段生成。而在NAC預處理的HL-60細胞中,caspase-3、caspase9和PARP三種蛋白均有明顯的變化。但是,iAsⅢ并沒有類似的作用效果。為了更加了解iAsⅢ對HL-60細胞的作用,我們進行了深入的實驗研究。首先,我們利用氧化熒光敏感探針(DCFH-DA)測定細胞體內(nèi)的活性氧(ROS)變化,并用流式細胞術檢測ROS的含量。γ-H2AX是一種DNA受損的標志物,我們使用免疫熒光法來檢測它的誘導情況。研究結果顯示,氧化應激在iAsⅢ的中間代謝產(chǎn)物(MMAⅢ和DMAⅢ)引起細胞凋亡過程中起著至關重要的作用,它不僅能夠引起線粒體膜電位的改變、DNA的損傷,同時它也能夠引起caspase家族的一系列級聯(lián)反應。我們的實驗結果表明,三價無機砷的中間代謝產(chǎn)物比于iAsⅢ有更好的治療效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36

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本文編號：2202294