【摘要】：研究目的:染色體t(8;21)(q22;q22)異位形成AML1-ETO融合基因,AML1-ETO融合蛋白能異常募集組蛋白脫乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)進(jìn)而抑制AML1靶基因的正常轉(zhuǎn)錄。HDAC抑制劑(HDACi)苯丁酸鈉(phenylbutyrate,PB)在處理AML1-ETO+ Kasumi-1細(xì)胞時能夠誘導(dǎo)凋亡分化,并伴隨AML1、PIG7等多種基因表達(dá)上調(diào)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)上調(diào)的ZFP36L2基因啟動子區(qū)有AML1的潛在結(jié)合位點。ZFP36L2是含CCCH鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白,通過加快mRNA的降解或抑制蛋白翻譯從而調(diào)控特異mRNA的表達(dá)。本研究旨在探討AML1對ZFP36L2是否具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,以及ZFP36L2蛋白在AML細(xì)胞系Kasumi-1和HL-60中的生物學(xué)功能,并探討其作用機制。研究方法:實時定量PCR(qRT-PCR)檢測ZFP36L2在AML1-ETO+患者細(xì)胞和細(xì)胞系中的表達(dá)。應(yīng)用qRT-PCR和Western blot技術(shù),檢測PB處理Kasumi-1細(xì)胞后ZFP36L2mRNA和蛋白表達(dá)變化。構(gòu)建包含AML1結(jié)合位點的ZFP36L2啟動子報告質(zhì)粒,應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),檢測轉(zhuǎn)錄因子AML1、AML1-ETO對ZFP36L2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并在CV-1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入外源AML1和AML1-ETO,應(yīng)用qRT-PCR和Western blot檢測內(nèi)源ZFP36L2 mRNA和蛋白水平變化。利用四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)體系Tet-On系統(tǒng),構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVX-Tight-Puro-ZFP36L2,通過PEI轉(zhuǎn)染方法,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收獲病毒,對Kasumi-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞進(jìn)行感染,篩選穩(wěn)定克隆。在強力霉素(doxycycline,Dox)誘導(dǎo)時,外源ZFP36L2基因可以表達(dá),而未經(jīng)Dox誘導(dǎo),外源導(dǎo)入的ZFP36L2基因不表達(dá),即可以通過Dox來控制該基因的表達(dá)與否。應(yīng)用qRT-PCR和Western blot,檢測ZFP36L2在mRNA和蛋白水平的可誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)ZFP36L2過表達(dá)時,檢測Kasumi-1和HL-60細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和分化等細(xì)胞生物學(xué)功能的改變,通過Western blot檢測凋亡蛋白和周期蛋白的改變。研究結(jié)果:ZFP36L2在白血病患者中低表達(dá),且ZFP36L2在M2b患者中的表達(dá)水平低于在非M2b患者中中表達(dá)水平,在AML1-ETO+細(xì)胞系Kasumi-1細(xì)胞中表達(dá)水平相對較低。PB處理誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡時,qRT-PCR和Western blot檢測顯示ZFP36L2在mRNA和蛋白水平表達(dá)均上升。AML1激活ZFP36L2啟動子報告質(zhì)粒,且激活作用呈劑量依賴性,而AML1-ETO對ZFP36L2啟動子報告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活沒有明顯作用。在CV-1細(xì)胞中過表達(dá)AML1可以上調(diào)內(nèi)源ZFP36L2的蛋白表達(dá);而過表達(dá)AML1-ETO對ZFP36L2的蛋白表達(dá)無明顯影響。當(dāng)ZFP36L2基因在Kasumi-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)時,細(xì)胞均表現(xiàn)增殖能力受抑制,細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,細(xì)胞凋亡增加,未檢測到細(xì)胞分化。相關(guān)凋亡蛋白和周期蛋白,出現(xiàn)相應(yīng)改變。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了 AML1新的靶基因—ZFP36L2。AML1轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活ZFP36L2表達(dá),過表達(dá)ZFP36L2抑制細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是腫瘤抑制因子。當(dāng)發(fā)生t(8;21)染色體異位形成AML1-ETO融合蛋白,上述作用減弱或消失,促進(jìn)白血病發(fā)生。本研究闡明了 AML1對ZFP36L2的調(diào)控作用,以及ZFP36L2在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)作用。
[Abstract]:Objective: to investigate the heterotopic formation of AML1-ETO fusion gene (AML1-Eto fusion protein) on chromosome t _ (8) (q22) and to recruit histone deacetylase (Histone Deacetylase,HDAC) to inhibit the normal transcription of AML1 target gene. HDAC inhibitor, (HDACi) phenylbutyrate (phenylbutyrate,PB), in the treatment of AML1-ETO Kasumi-1 cells Can induce apoptosis and differentiation, The expression of many genes such as AML1,PIG7 was up-regulated. Bioinformatics analysis showed that the up-regulated ZFP36L2 gene promoter had the potential binding site of AML1. ZFP36L2 was a RNA binding protein containing CCCH zinc finger structure, which regulated the expression of specific mRNA by accelerating the degradation of mRNA or inhibiting the translation of mRNA. The aim of this study was to investigate the transcriptional regulation of AML1 on ZFP36L2 and the biological function of ZFP36L2 protein in AML cell line Kasumi-1 and HL-60, and to explore its mechanism. Methods: real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of ZFP36L2 in AML1-ETO cells and cell lines. QRT-PCR and Western blot techniques were used to detect the changes of ZFP36L2mRNA and protein expression in Kasumi-1 cells treated with PB. The reporter plasmid of ZFP36L2 promoter containing AML1 binding site was constructed, and the transcriptional regulation of ZFP36L2 by the transcription factor AML1,AML1-ETO was detected by using double luciferase reporter gene system. Exogenous AML1 and AML1-ETO, were transferred into CV-1 cells respectively to detect the changes of endogenous ZFP36L2 mRNA and protein levels by qRT-PCR and Western blot. The lentivirus expression vector pLVX-Tight-Puro-ZFP36L2, was constructed by using tetracycline induced expression system Tet-On system. The lentivirus expression vector pLVX-Tight-Puro-ZFP36L2, was transfected into HEK293T cells by PEI transfection, and the virus was harvested. Kasumi-1 cells and HL-60 cells were infected and stable clones were screened. During the induction of doxycycline (doxycycline,Dox), the exogenous ZFP36L2 gene can be expressed, but without the Dox induction, the exogenous ZFP36L2 gene can not be expressed, that is, the expression of the gene can be controlled by Dox. QRT-PCR and Western blot, were used to detect the inducible expression of ZFP36L2 at mRNA and protein levels. When ZFP36L2 overexpression was induced, the proliferation, apoptosis, cell cycle and differentiation of Kasumi-1 and HL-60 cells were detected. The changes of apoptotic protein and cyclin were detected by Western blot. The results showed that the expression level of ZFP36L2 in M2b patients was lower than that in non-M2b patients, and the expression of ZFP36L2 in leukemia patients was lower than that in non-M2b patients. The expression level of ZFP36L2 in Kasumi-1 cells was relatively low. PB treatment induced apoptosis of Kasumi-1 cells. The results of qRT-PCR and Western blot showed that the expression of ZFP36L2 increased at mRNA and protein levels. AML1 activated ZFP36L2 promoter reporter plasmid in a dose-dependent manner. However, AML1-ETO had no significant effect on the transcriptional activation of ZFP36L2 reporter plasmids. Overexpression of AML1 could up-regulate the protein expression of endogenous ZFP36L2 in CV-1 cells, but overexpression of AML1-ETO had no effect on the expression of ZFP36L2 protein. When ZFP36L2 gene was induced to express in Kasumi-1 cells and HL-60 cells, cell proliferation was inhibited, cell cycle was blocked in G0/G1 phase, apoptosis was increased, and cell differentiation was not detected. The related apoptotic proteins and cyclins changed accordingly. Conclusion: the new target gene of AML1-ZFP36L2.AML1 transcriptional regulation activates the expression of ZFP36L2. Overexpression of ZFP36L2 inhibits cell proliferation, blocks cell cycle, induces apoptosis, and is a tumor suppressor. When the t (8) chromosome ectopic formed AML1-ETO fusion protein, the above effects were weakened or disappeared, and promoted the development of leukemia. The purpose of this study was to elucidate the regulatory effect of AML1 on ZFP36L2 and the biological role of ZFP36L2 in leukemia cells.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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本文編號：2200166