【摘要】：第一部分EPAS1通過EGFR和MET信號通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌TKI耐藥性目的:肺癌已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌包括常見的鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等,與小細(xì)胞癌相比其癌細(xì)胞生長分裂較慢,擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%,其中約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,5年生存率很低。近年來隨著藥物基因組學(xué)的開展,非小細(xì)胞肺癌的藥物相關(guān)研究大幅度提升,一方面,為更好地發(fā)揮化療效應(yīng)起到指導(dǎo)作用;另一方面越來越多的靶向藥物被研制出來,在腫瘤治療方面起到了許多令人鼓舞的成果。在肺癌的靶向治療、轉(zhuǎn)移因素、耐藥性方面我們做了許多探索。目前針對第一代靶向治療藥物EGFR-TKI,以吉非替尼和厄洛替尼為代表,對于初治的非小細(xì)胞肺癌患者,中位PFS可達(dá)10個(gè)月,隨之而來的耐藥性函待解決。因此相關(guān)領(lǐng)域一些新的蛋白基因受體研究異常火熱。本研究旨在探究是否有其他因子參與了EGFR與MET的調(diào)控,我們對全基因組中HIF-1α的類似物進(jìn)行了篩查。其家族成員EPAS1在EGFR調(diào)控MET中的作用我們進(jìn)行了系統(tǒng)研究,我們將HA標(biāo)記的EPAS1(HA-EPAS1)與Myc標(biāo)記的EGFR(Myc-EGFR)共同轉(zhuǎn)染至HCC827細(xì)胞中,并使用HA的抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。以確認(rèn)這種結(jié)合是否具有細(xì)胞特異性,同時(shí)我們在A549中進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步探究EPAS1和T790M EGFR的結(jié)合是否為直接結(jié)合,我們使用了DTME作為交聯(lián)劑進(jìn)行蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。再者,為了研究MET信號通路是否受EPAS1與T790M EGFR的相互作用影響,我們在HCC827細(xì)胞系中同時(shí)分別過表達(dá)EPAS1、野生型EGFR以及T790M EGFR,并檢測MET的表達(dá)量。關(guān)于EPAS1與T790M EGFR是否依賴于配體,我們構(gòu)建了配體結(jié)合域缺失的載體ΔN-T790M,并將其與EPAS1共同轉(zhuǎn)染至HCC827細(xì)胞中。為了探究EPAS1與T790M EGFR的相互作用對NSCLC藥物耐受的作用,我們將EPAS1與T790M EGFR共同轉(zhuǎn)染至HCC827細(xì)胞中以EPAS1載體的空載作為對照,并使用吉非替尼和埃羅替尼處理細(xì)胞,用克隆實(shí)驗(yàn)檢測分別共轉(zhuǎn)染EASP1與T790M EGFR以及野生型EGFR對NSCLC對TKI處理的藥物抵抗作用。最后為了探究EPAS1與T790M EGFR的相互作用是否通過MET信號通路來發(fā)揮作用的,我們敲低了內(nèi)源的MET的表達(dá)并檢測了細(xì)胞增殖和生長情況。方法:細(xì)胞培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞系HCC827和A549購自美國ATCC(馬納薩斯)并且從收到細(xì)胞到完成文章不超過六個(gè)月時(shí)間。細(xì)胞用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,2 m M-左旋谷酰胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),同時(shí)將細(xì)胞放入37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒構(gòu)建將EPAS1編碼序列克隆到N端含HA標(biāo)簽的p CMV-HA質(zhì)粒中,同時(shí)將配體結(jié)合域確實(shí)的突變型EGFR(氨基酸2-620)克隆到N端含Myc標(biāo)簽的pc DNA3.1質(zhì)粒中。免疫熒光將HCC817轉(zhuǎn)染HA-標(biāo)記的EPAS1質(zhì)粒并將細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)小室中,檢測時(shí)用4%甲醛固定三十分鐘,接著使用0.2%Triton X-100破膜5分鐘,使用5%BSA進(jìn)行封閉。使用鼠源的抗HA的一抗室溫孵育并使用Alexa Fluor 488羊抗鼠熒光二抗室溫孵育30分鐘后使用DAPI作為DNA染料。在抗體孵育后,細(xì)胞用PBS清洗并用抗熒光猝滅封片劑進(jìn)行封片。免疫沉淀和蛋白免疫印跡蛋白裂解使用RIPA裂解液,配方為50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150 m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS并添加蛋白抑制劑。將裂解完的細(xì)胞用4℃的冰凍離心機(jī)12000rpm/min離心10min,將上清與瓊脂糖球體以及抗HA和抗Myc的抗體4℃共同孵育2h。將孵育后的瓊脂糖珠用裂解液清洗三遍后用最終洗脫液(50 m M Tris,p H 7.5,and 50 m M Na Cl)清洗兩遍。將瓊脂糖朱用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫下來并95℃熱變性5min,使用SDA-PAGE膠進(jìn)行蛋白分離并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉2h,并在4℃孵育一抗過夜。在用PBST清洗后,用含辣根過氧化酶的二抗進(jìn)行孵育2h后再用PBST清洗后進(jìn)行爆片。蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)將HCC827細(xì)胞共轉(zhuǎn)染EPAS1和野生型或突變型T790M EGFR后收集細(xì)胞并在4℃冰凍離心機(jī)中800g離心10 min并用PBS重懸。將交聯(lián)劑用DMSO溶解后備用并將其加入到細(xì)胞懸液中使終濃度為0.1m M,在4℃孵育2 h。使用RIPA裂解液進(jìn)行理解并進(jìn)行蛋白免疫沉淀反應(yīng)。蛋白使用添加DTT或未添加DTT的SDS-PAGE上樣緩沖液進(jìn)行洗脫并進(jìn)行蛋白免疫印跡。RNA干擾和熒光定量PCR為了進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn),靶向MET的慢病毒載體sh RNA V2LHS_113750和V3LHS_318637購自GE Dharmacon公司。細(xì)胞使用慢病毒轉(zhuǎn)染體系并用1μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選得到穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株。為了檢驗(yàn)干擾效率我們提取了細(xì)胞的總RNA并使用全式金Easy Script Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)1μg總RNA,同時(shí)使用GAPDH m RNA水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并將所有基因表達(dá)量展現(xiàn)為相對值。細(xì)胞增殖,生長和存活分析細(xì)胞生長使用MTT法進(jìn)行分析。細(xì)胞使用TKIs處理72 h后進(jìn)行檢測并標(biāo)準(zhǔn)化為空白組的表達(dá)。克隆形成實(shí)驗(yàn)用來檢測細(xì)胞生長情況。所有濃度的藥物處理經(jīng)過五次單獨(dú)的檢測并展示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)都展示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用雙尾檢測的T檢驗(yàn)來檢測兩組之間的差異,當(dāng)p0.05是認(rèn)為存在顯著的差異。結(jié)果:結(jié)果顯示EPAS1(NCBI Reference Sequence:NP_001421.2)作為最為同源的基因擁有與HIF-1α48%的相似的氨基酸序列。野生型的EGFR與EPAS1并無結(jié)合,然而將790蘇氨酸突變?yōu)榈鞍彼岬馁|(zhì)粒Myc-T790M與HA-EPAS1共同轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞系HCC827中后,蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示EPAS1與突變的EGFR具有結(jié)合。同樣在A549細(xì)胞系中也有類似的結(jié)果。同樣,在A549細(xì)胞中EASP1也只與T790M結(jié)合而不與野生的EGFR結(jié)合,這提示其相互作用不存在細(xì)胞特異性。EPAS1與野生型的EGFR確實(shí)不存在結(jié)合而在添加劑中消除DTT后能夠出現(xiàn)T790MEGFR與EPAS1相結(jié)合的帶,而添加DTT后這種結(jié)合消失了,這提示EPAS1與T790M EGFR的結(jié)合是直接結(jié)合。單獨(dú)過表達(dá)野生型EGFR和T790M EGFR能夠顯著上調(diào)MET的表達(dá)量,單獨(dú)表達(dá)EPAS1則對MET的表達(dá)量并沒有太大影響,并且同時(shí)表達(dá)EPAS1和野生型EGFR與單獨(dú)表達(dá)野生型EGFR也并未有顯著提升,然而同時(shí)表達(dá)EPAS1和T790M EGFR能夠顯著上調(diào)MET的表達(dá)。ΔN-T790M與EPAS1共同轉(zhuǎn)染后能夠顯著上調(diào)MET的表達(dá),這提示EPAS1與T790M EGFR相互作用對MET的激活作用不依賴于配體。共同轉(zhuǎn)染EPAS1與T790M EGFR后HCC827的吉非替尼的EC50提升至10μM以上,埃羅替尼的EC50提升到5μM,而只表達(dá)T790M EGFR對照組僅為0.1μM和0.6μM,這提示EPAS1與T790M EGFR的相互作用能夠增加NSCLC對TKI抑制劑的耐受性。干擾MET后HCC827的EC50分別下調(diào)至0.005μM和0.09μM,這提示EPAS1與T790M EGFR相互作用促進(jìn)NSCLC對TKI的耐藥性是通過MET信號通路來發(fā)揮作用的。結(jié)論:1在非小細(xì)胞肺癌中EPAS1作為HIF-1α同系物可與T790M EGFR相結(jié)合2 EPAS1與T790M EGFR相互作用能夠不依賴于配體結(jié)合而激活MET信號通路3 EPAS1誘導(dǎo)的NSCLC的TKI抵抗是通過T790M EGFR和MET信號通路來發(fā)揮作用的第二部分mi R-200a通過靶向EGFR和c-Met抑制NSCLC對吉非替尼的藥物抵抗性目的:為了研究mi R-200a在NSCLC中的作用,我們分別用q RT-PCR法檢測了NSCLC細(xì)胞株(H3255,H1975和HCC827)和正常肺細(xì)胞(MRC-5和CCD-19Lu)中mi R-200a的表達(dá)量。關(guān)于EGFR和c-Met是否為mi R-200a的直接靶點(diǎn),我們構(gòu)建了包含mi R-200a匹配EGFR和c-Met 3’UTR的報(bào)告基因野生型和突變型質(zhì)粒。同時(shí)我們將EGFR和c-Met報(bào)告基因質(zhì)粒分別與mi R-200a mimics或mi R-NC mimics共同轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞中,通過檢測熒光表達(dá)量檢測mi R-200a對EGFR和c-Met的抑制作用。為了驗(yàn)證mi R-200a對NSCLC的作用效果,我們分別在H3255,H1975和HCC827細(xì)胞中過表達(dá)mi R-200a和mi R-NC,并通過細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。同時(shí)使用MTT實(shí)驗(yàn)和Brd U實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞增殖情況。最后為了檢測不同的過表達(dá)mi R-200a的NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的影響,我們使用了細(xì)胞增殖和生長實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞對不同濃度吉非替尼濃度的影響。方法:細(xì)胞培養(yǎng):人肺正常細(xì)胞MRC-5和CCD-19Lu和人肺癌細(xì)胞系H3255,H1975以及HCC827購自美國ATCC。H3255具有L858R EGFR等位基因,H1978具有L858R/T790M EGFR等位基因,而HCC827具有EGFR E746-A4750確實(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)嚴(yán)格按照ATCC培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)并且在實(shí)驗(yàn)全部完成之前不超過6個(gè)月。細(xì)胞使用含10%胎牛血清以及1%的青鏈霉素在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將10μM mi RNA寡聚核苷酸以及10μl Lipofectamine 2000分別與500μl Opti-MEM均勻分布后再充分混合并在室溫孵育20分鐘。將混合液加入到含60%融合度細(xì)胞的六孔板中,并在37℃培養(yǎng)兩天。Mi RNA轉(zhuǎn)染Hsa-mi R-200a過表達(dá)和對照寡聚核苷酸購自ABI公司其序列為5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3。將mi RNA寡聚核苷酸按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染RNA提取和熒光定量PCR反應(yīng)按說明書使用Trizol對總RNA進(jìn)行提取。使用Taq Man Pri-mi RNA分析試劑盒對mi R表達(dá)量進(jìn)行分析,使用RNU48作為內(nèi)參并標(biāo)準(zhǔn)化。為了檢測EGFR和c-Met m RNA的表達(dá)量使用Easy Script Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)體系對1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)。從反轉(zhuǎn)好的20μl c DNA中吸取2μl進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量定量PCR反應(yīng)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將EGFR和c-Metd 3’-UTR區(qū)域克隆至p MIR-REPORT報(bào)告基因質(zhì)粒中,其突變質(zhì)粒使用PCR方法進(jìn)行構(gòu)建。將HCC827細(xì)胞傳到24孔板中每孔80000個(gè)細(xì)胞。使用Lipofectamine2000法將hsa-mi R-200a或mi R-contro和野生型、突變型報(bào)告基因質(zhì)粒以及p RL-TK分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。蛋白提取和蛋白免疫共沉淀蛋白使用RIPA裂解液進(jìn)行提取,配方為50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鹽,0.1%SDS使用前添加蛋白抑制劑。將裂解的蛋白12,000 rpm/min 4°C離心10 min。使用SDA-PAGE膠進(jìn)行蛋白分離并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉2h,并在4℃孵育EGFR和c-Met一抗過夜。在用PBST清洗后,用含辣根過氧化酶的二抗進(jìn)行孵育2h后再用PBST清洗后進(jìn)行爆片。細(xì)胞劃痕將細(xì)胞傳至六孔板中,每孔種細(xì)胞1×105個(gè)病轉(zhuǎn)染mi R-200a或?qū)φ蘸塑账�。使�?0μl槍頭對細(xì)胞進(jìn)行劃痕,去除殘余細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基重新培養(yǎng)。在細(xì)胞劃痕后24h進(jìn)行拍照。細(xì)胞侵襲將1×105轉(zhuǎn)染過mi R-200a和對照的細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基重懸并傳至Matrigel覆蓋的小室上方在小室下方放置500μl含10%血清的培養(yǎng)基并在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h后進(jìn)行拍照。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)吉非替尼處理和未處理細(xì)胞的增殖情況用MTT實(shí)驗(yàn)和Brd U實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。細(xì)胞在用吉非替尼處理72后進(jìn)行檢測并換算成對照細(xì)胞的相對比例。數(shù)據(jù)為五次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)并展示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)都展示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用雙尾檢測的T檢驗(yàn)來檢測兩組之間的差異,當(dāng)p0.05是認(rèn)為存在顯著的差異。結(jié)果:在正常的肺細(xì)胞系MRC-5和CCD-19Lu中mi R-200a的表達(dá)量接近,然而與MRC-5細(xì)胞相比,H3255細(xì)胞中mi R-200a的表達(dá)量僅為MRC-5的20%,而H1975和HCC827也只分別為33%和25%。上述結(jié)果顯示,與正常肺癌細(xì)胞相比,mi R-200a的表達(dá)量明顯下調(diào)。結(jié)果顯示mi R-200a能夠顯著抑制EGFR和c-Met的野生型熒光素酶報(bào)告基因的活性,而突變型對照組則沒有顯著變化。以上結(jié)果顯示mi R-200a能夠通過靶向EGFR和c-Met的3’UTR區(qū)域來抑制其活性。結(jié)果顯示對照組遷移的平均距離分別為281μm,326μm以及252μm,而轉(zhuǎn)染mi R-200a組遷移的平均距離顯著下降到134μm,168μm以及83μm,與對照組相比下調(diào)了至少47%。同樣與預(yù)期一樣,轉(zhuǎn)染mi R-200a的NSCLC細(xì)胞的遷移能力與對照組相比出現(xiàn)顯著下降。此外,MTT法和Brd U法檢測細(xì)胞活性和細(xì)胞增值能力,結(jié)果顯示,過表達(dá)mi R-200a能夠顯著抑制NSCLC細(xì)胞的活性和增殖能力。以上結(jié)果顯示,mi R-200a能夠顯著抑制NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和細(xì)胞增殖,揭示了mi R-200a對NSCLC細(xì)胞功能的抑制作用。各轉(zhuǎn)染對照組的細(xì)胞中,含L858R EGFR突變的H3255細(xì)胞株對于吉非替尼的抵抗較小其EC50為0.07μM,同時(shí)含有L858R和T790M突變的H1975細(xì)胞對吉非替尼的耐受最為強(qiáng)烈,其EC50為10μM,而不含二者突變的HCC827細(xì)胞作為陰性對照其EC50為10μM。轉(zhuǎn)染mi R-200a后其EC50分別為0.008μM,0.004μM而陰性對照組則沒有明顯變化。這提示mi R-200a能夠提高NSCLC對TKI的藥物敏感性。結(jié)論:1 mi R-200a在NSCLC細(xì)胞中下調(diào)2 mi R-200a能夠直接靶向抑制EGFR和c-Met的表達(dá)3 mi R-200a抑制NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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本文編號：2191019