【摘要】：研究背景食管癌是世界上常見的惡性腫瘤,已經(jīng)成為全球死亡的主要原因之一,且發(fā)病有明顯的地域和組織學類型上的差異。上皮來源的食管癌有兩種主要病理類型:食管鱗狀細胞癌和食管腺癌。在中國,食管鱗狀細胞癌是食管癌的主要病理類型,大約占總數(shù)的90%以上。盡管食管癌診斷及治療已有較大的進展,但是食管癌預后仍較差,總體5年生存率仍然處于較低的水平。其主要原因是缺乏有效的早期食管癌檢測方法及進行合理的規(guī)范化治療。因此,如何篩選出更多有效的腫瘤標志物及尋找食管癌治療的潛在靶點已成為目前基礎(chǔ)和臨床研究的主要方向。人類基因組中只有不到2%的序列為蛋白質(zhì)編碼,其他序列雖然不編碼蛋白質(zhì),但超過90%能被轉(zhuǎn)錄成RNA。這些不能為蛋白質(zhì)編碼的RNA分子統(tǒng)稱為非編碼RNA。非編碼RNA參與了多種生物學過程,并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。非編碼RNA基于規(guī)模大致分為兩大類:短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA。作為非編碼RNA中的新角色,長鏈非編碼RNA在各種疾病尤其是腫瘤中起重要調(diào)控作用,成為腫瘤研究的熱點。長鏈非編碼RNA在多種層面上(表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后調(diào)水平)調(diào)控基因的表達。大量證據(jù)表明多種長鏈非編碼RNA在多類腫瘤中存在異常表達,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌或抑癌作用。HOX轉(zhuǎn)錄RNA(HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌中具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編RNA。近年來,越來越多的研究表明長鏈非編碼RNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此,探索腫瘤相關(guān)長鏈非編碼RNA以及與蛋白編碼基因之間的相互關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤生物研究領(lǐng)域的重要課題。長鏈非編碼RNA H19作為印記基因的非編碼轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)物,其父源印記母系等位基因表達,不具編碼蛋白能力。新近研究表明,H19位點缺失導致其在膀胱癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)較高豐度的表達,發(fā)現(xiàn)其具有原癌活性。但也有研究認為H19具有抑癌活性,可以抑制腫瘤的惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管的形成。更加引人關(guān)注的是H19有望成為臨床早期診斷和預后判斷新的標志物,也為腫瘤的治療提供了一種新的思路。目的長鏈非編碼rnah19在食管癌中的生物學功能以及病理學機制尚不明確。本研究旨在探討h19在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機制。材料方法1.收集本科室2007-2012年行腫瘤切除術(shù)的64例食管癌患者的組織標本,采用qrt-pcr的方法,定量檢測了h19在64對食管癌組織及對應的正常食管組織中的表達水平,并分析h19的表達水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。2.采用qrt-pcr的方法檢測h19在正常食管上皮細胞株het-1a及食管癌細胞株ec109,ec9706,kyse150和kyse450中的表達水平,選擇明顯高表達的食管癌細胞株作為進一步研究的實驗對象進行后續(xù)功能研究。3.通過sirna干擾技術(shù)沉默h19在食管癌細胞株ec109、ec9706中的表達水平,并通過cck-8法、細胞周期實驗、裸鼠原位成瘤實驗、transwell細胞遷移侵襲實驗檢測h19表達干擾后對食管癌細胞株的生長、遷移、侵襲等腫瘤細胞學行為的影響。4.經(jīng)westernblot法分析h19沉默對emt上皮標志物e-cadherin,間質(zhì)標志物vimentin及其mmps家族中mmp-9蛋白表達的影響。結(jié)果1.長鏈非編碼rnah19在食管癌組織的表達水平均明顯高于癌旁正常組織;在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中可能擔當重要的角色。其表達與患者腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),與年齡、性別與腫瘤分化程度無關(guān)。2.本研究通過對4種食管癌細胞株及正常上皮細胞株中h19的檢測,證實h19在食管癌細胞株里的表達水平也明顯高于食管正常上皮細胞株。食管癌細胞株ec109及ec9706明顯高表達h19,可以作為進一步研究的實驗對象。3.通過sirna干擾技術(shù)沉默h19在食管癌細胞株ec109、ec9706中的表達水平后,cck-8法檢測h19表達下調(diào)后可顯著抑制食管癌細胞的增殖能力。流式細胞儀檢測h19表達干擾后食管癌細胞株發(fā)生g0/g1期阻滯。為了進一步探討h19在體內(nèi)的促癌生長作用,我們利用h19干擾ec9706細胞株及陰性對照組進行了裸鼠皮下成瘤實驗,發(fā)現(xiàn)h19干擾細胞株在裸鼠皮下的成瘤能力明顯受到抑制,其腫瘤體積及重量均明顯低于陰性對照組。我們進一步懫用transwell小室研究了h19表達干擾細胞株ec109和ec9706的遷移和侵襲能力,結(jié)果表明,h19表達干擾細胞株的遷移和侵襲能力較對照組明顯抑制。4.Western blot結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,抑制H19表達后,食管癌細胞上皮細胞標志物E-cadherin表達水平明顯增高,間質(zhì)細胞標志物vimentin及MMP-9蛋白的表達水平下調(diào)。結(jié)論綜上所述,本研究顯示長鏈非編碼RNA H19在食管癌組織中表達上調(diào),在食管癌中作為促癌基因促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。其分子機制可能通過介導EMT的發(fā)生促進食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移,抑制H19的表達能夠阻滯EMT的發(fā)生。長鏈非編碼RNA H19在食管癌轉(zhuǎn)移過程中有重要的調(diào)控作用,有可能成為食管癌治療的一個潛在分子靶點。
[Abstract]:Background Esophageal cancer is one of the most common malignant tumors in the world and has become one of the leading causes of death worldwide. There are two major pathological types of epithelial esophageal cancer: esophageal squamous cell carcinoma and esophageal adenocarcinoma. Although the diagnosis and treatment of esophageal cancer have made great progress, the prognosis of esophageal cancer is still poor, and the overall 5-year survival rate is still at a low level. Effective tumor markers and potential targets for esophageal cancer therapy have become the main directions of basic and clinical research. Only less than 2% of human genome sequences are encoded by proteins. Although other sequences do not encode proteins, more than 90% of them can be transcribed into RNA. Coded RNA. Non-coding RNA participates in many biological processes and plays an important role in tumorigenesis and development. Long chain non coding RNA regulates gene expression at various levels (epigenetic level, transcriptional level and post transcriptional regulation level). A large number of evidence shows that a variety of long-chain non coding RNA have abnormal expression in many kinds of tumors, and play a role in promoting cancer or inhibiting cancer in the process of tumor occurrence and development..HOX transcription RNA (HOTAIR) is the key point of tumor research. In recent years, more and more studies have shown that the abnormal expression of long-stranded non-coding RNA is closely related to the occurrence, development, invasion and metastasis of tumors. Therefore, to explore long-stranded non-coding RNA and protein-coding genes related to tumors. Long-stranded noncoding RNA H19, as a noncoding transcript product of imprinted genes, has no ability to encode proteins because of its paternally imprinted maternal allele expression. H19 has been shown to be highly expressed and has proto-oncogenic activity. However, some studies have suggested that H19 can inhibit the malignant proliferation, invasion, metastasis and neovascularization of tumors. Objective The biological function and pathological mechanism of long-chain non-coding rnah19 in esophageal cancer are still unclear. This study was designed to explore the role of H19 in the occurrence, development and molecular mechanism of esophageal cancer. Materials and Methods 1. The tissue specimens of 64 patients with esophageal cancer who underwent tumor resection in our department from 2007 to 2012 were collected and QR was used. T-pcr was used to quantitatively detect the expression of H19 in 64 esophageal cancer tissues and corresponding normal esophageal tissues, and to analyze the correlation between the expression of H19 and the clinicopathological parameters of patients. 2. the expression of H19 in normal esophageal epithelial cell lines het-1a and esophageal cancer cell lines ec109, ec9706, kyse150 and KYSE450 was detected by qrt-pcr. 3. Silencing the expression of H19 in esophageal cancer cell lines Ec109 and EC9706 by siRNA interference technique, and through CCK-8 method, cell cycle test, in situ tumorigenesis test in nude mice, Transwell cell migration and invasion test The effects of H19 silencing on the expression of MMP-9 protein in EMT epithelial marker e-cadherin, interstitial marker vimentin and its MMPs family were analyzed by Western blot. results 1. The expression of H19 may play an important role in the occurrence and development of esophageal cancer. The expression of H19 is significantly related to the depth of tumor invasion and lymph node metastasis, and is not related to age, sex and tumor differentiation. 2. The detection of H19 in four esophageal cancer cell lines and normal epithelial cell lines confirmed that H19 is present. Esophageal cancer cell lines Ec109 and EC9706 were significantly higher than normal esophageal epithelial cell lines. The proliferation of esophageal cancer cells was significantly inhibited. The g0/g1 phase arrest of esophageal cancer cell lines was detected by flow cytometry. In order to further explore the effect of H19 on the growth of esophageal cancer cells in vivo, we used H19 to interfere with EC9706 cell line and negative control group to carry out subcutaneous tumorigenesis test in nude mice. Subcutaneous tumorigenesis was significantly inhibited, and the tumor volume and weight were significantly lower than those in the negative control group. We further studied the migration and invasion of h19-interfering cell lines Ec109 and EC9706 by Transwell chamber. The results showed that h19-interfering cell lines migration and invasion were significantly inhibited. The results of blot showed that after inhibiting the expression of H19, the expression of E-cadherin, the epithelial markers, and the expression of vimentin and MMP-9 were down-regulated in esophageal cancer cells. As an oncogene promoting tumor cell growth and metastasis, long-stranded non-coding RNA H19 may play an important role in the regulation of metastasis of esophageal cancer and may be a potential therapeutic factor for esophageal cancer. Subtarget.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：2190284