【摘要】：研究背景:乳腺癌是全世界范圍內女性發(fā)病率最高的一類惡性腫瘤。目前,尚無理想的體外分子標志物可用于乳腺癌的早期診斷。大量研究表明:伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,患者腫瘤組織及體液中蛋白質糖基化水平常發(fā)生異常改變。本研究從唾液檢測入手,利用高靈敏度且高通量的糖鏈檢測技術——凝集素芯片,對健康女性志愿者(healthy volunteers,HV)、良性乳腺腫瘤/囊腫患者(benign breast diseases patients,BB)、Ⅰ期乳腺癌患者(patients with breast cancer in Ⅰ stage,BC-Ⅰ)以及 Ⅱ 期乳腺癌患者(patients with breast cancer in Ⅱ stage,BC-Ⅱ)的唾液蛋白質糖鏈結構進行比較分析,期望發(fā)現異常的唾液蛋白質糖鏈結構,討論其作為檢測指標應用于乳腺癌患者早期診斷的可能性。實驗方法:本研究首先應用凝集素芯片,對HV、BB、BC-Ⅰ以及BC-Ⅱ混合唾液樣本(各30例混合)中的蛋白質糖鏈結構進行分析,比較四組混合唾液中蛋白質糖鏈結構的差異,并通過凝集素印跡實驗驗證;隨后,應用凝集素芯片對新收集的139例訓練集樣本(36例HV,35例BB,36例BC-Ⅰ以及32例BC-Ⅱ)進行個例分析,篩選可用于鑒別診斷BB、BC-Ⅰ和BC-Ⅱ唾液樣本的候選凝集素,并利用二元逐步Logistic回歸分析構建診斷模型;最后,在127例驗證集樣本(31例HV,30例BB,30 例 BC-Ⅰ 以及 36 例 BC-Ⅱ)中通過 ROC 曲線分析(receiver operating characteristic curve)評估診斷模型對BB、BC-Ⅰ和BC-Ⅱ的鑒別能力。實驗結果:1.混合唾液樣本凝集素芯片結果表明,11種凝集素的歸一化熒光強度值(normalized fluorescent intensities,NFIs)在 HV、BB、BC-Ⅰ 以及 BC-Ⅱ 混合樣本中具有顯著差異:其中5種凝集素(DBA、PNA、PHA-E+L、UEA-I和PWM)特異性識別的 αGalNAc、GalNAcαl-3(Fucαl-2)Gal、Galβl-3GalNAcα、平分型 GlcNAc、多天線型N-聚糖、Fucαl-2Ga1β1-4Glc(NAc)以及分支(LacNAc)n糖鏈在至少一種乳腺疾病患者唾液中較HV表達水平發(fā)生改變。另外6種凝集素(MAL-Ⅰ、ECA、NPA、BPL、PTL-Ⅱ 和 BS-Ⅰ)特異性識別的 Galβl-4/3GlcNAc、High-Man、Manαl-6Man、Ga1β1-3GalNAcα-Ser/Thr 以及 Galαl-3/6Gal/Glc 糖鏈結構表達水平在 BB、BC-Ⅰ或BC-Ⅱ混合唾液樣本中具有顯著性差異。隨后利用4種凝集素(PHA-E+L、NPA、MAL-Ⅰ以及BS-Ⅰ)進行凝集素印跡實驗,證明了混合唾液樣本芯片結果的準確性。2.經過訓練集個例唾液凝集芯片進一步篩選,11種凝集素中的8種凝集素(PNA、PHA-E+L、UEA-Ⅰ、PWM、MAL-Ⅰ、NPA、BS-Ⅰ 和 PTL-Ⅱ)以及 PHA-E 作為候選凝集素進行ROC曲線分析。結果發(fā)現僅有PHA-E+L和PWM具有較高的鑒別診斷能力(ROC曲線線下面積(AUC)0.70),表明單一凝集素無法應用于BB、BC-I和BC-Ⅱ樣本的鑒別。因此基于9種候選凝集素,通過Logistic回歸構建4個診斷模型:Model BD、Model BB、Model BC-Ⅰ及Model BC-Ⅱ用于鑒別不同乳腺疾病患者。經驗證集個例樣本驗證,Model BD獲得了較好的診斷效果(AUC:0.902、靈敏度:0.823、特異性:0.839),能夠準確鑒別出96例乳腺疾病患者中的79例,31例HV中的26例;Model BB(AUC:0.796、靈敏度:0.727、特異性:0.767)可準確鑒別出30例BB中的23例,66例乳腺癌患者中的48例;此外,Model BC-Ⅰ(AUC:0.781、靈敏度:0.700、特異性:0.864)可準確鑒別出30例BC-Ⅰ組中的21例,其余兩個患病組66例樣本中的57例;而Model BC-Ⅱ(AUC:0.759、靈敏度:0.861、特異性:0.550)可準確鑒別出36例BC-Ⅱ組中的31例,其余兩個患者組60例樣本中的33例。驗證集中診斷模型的ROC-AUC值均高于0.75,仍能具有較高的鑒別診斷能力,表明乳腺癌患者唾液中蛋白質的異常糖鏈結構有望成為潛在的體外檢測標志物,用于乳腺癌患者的早期篩查。
[Abstract]:Background: Breast cancer is one of the most common malignancies in women worldwide. At present, there is no ideal in vitro molecular marker for early diagnosis of breast cancer. Starting with saliva detection, lectin chip, a highly sensitive and high throughput sugar chain detection technique, was used to detect healthy volunteers (HV), benign breast cancer patients (BB), patients with stage I breast cancer in stage I, BC-I, and stage II breast cancer. The glycan structure of salivary protein in patients with breast cancer in stage II (BC-II) was compared and analyzed. The abnormal glycan structure of salivary protein was expected to be found and the possibility of early diagnosis of breast cancer as a detection index was discussed. The structure of protein glycan in mixed saliva samples (30 cases each) was analyzed, and the difference of protein glycan in mixed saliva was compared among the four groups, which was verified by agglutinin imprinting test. Then, 139 new training samples (36 HV, 35 BB, 36 BC-I and 32 BC-II) were collected by agglutinin chip. A case study was conducted to screen candidate lectins for differential diagnosis of BB, BC-I and BC-II saliva samples, and a diagnostic model was constructed using binary stepwise logistic regression analysis. Finally, ROC curve analysis was performed in 127 validation samples (31 HV, 30 BB, 30 BC-I and 36 BC-II). The results showed that: 1. The normalized fluorescent intensities (NFIs) of 11 kinds of agglutinin were significantly different in the mixed samples of HV, BB, BC-I and BC-II. Five kinds of agglutinin (DBA, PNA, PHA-E) +L, UEA-I, and PWM-specific alpha GalNAc, GalNAc alpha L-3 (Fuc alpha l-2) Gal, Gal beta l-3Gal NAc alpha, bisected GlcNAc, multi-antenna N-glycans, Fuc alpha l-2Ga1 beta 1-4Glc (NAc) and branched (LacNAc) n chains were altered in saliva of at least one breast disease compared with HV expression levels. Six other agglutinins (MAL-I, ECA, BPL, PTL-I I, NPA, and LacNAC) were also altered. S-I-specific recognised levels of Gal-beta-l-4/3G LCNAc, High-Man, Man-alpha-l-6Man, Ga-1-beta-3G alNAc alpha-Ser/Thr and Gal-alpha-l-3/6Gal/Glc sugar chains were significantly different in BB, BC-I or BC-II mixed saliva samples. Four kinds of lectins (PHA-E+L, NPA, MAL-I and BS-I) were subsequently used for lectin imprinting experiments to verify the results. Accuracy of mixed saliva sample microarray results. 2. After further screening of training samples, eight lectins (PNA, PHA-E+L, UEA-I, PWM, MAL-I, NPA, BS-I and PTL-II) and PHA-E as candidate lectins were analyzed by ROC curves. Only PHA-E+L and PWM were found to be highly differentiated. Diagnostic ability (AUC) 0.70 indicated that single lectin could not be used to differentiate BB, BC-I and BC-I I samples. Therefore, based on nine candidate lectins, four diagnostic models were constructed by logistic regression: Model BD, Model BB, Model BC-I and Model BC-I I for differentiating patients with different breast diseases. Model BD (AUC: 0.902, sensitivity: 0.823, specificity: 0.839) can accurately identify 79 out of 96 patients with breast diseases, 26 out of 31 patients with HV; Model BB (AUC: 0.796, sensitivity: 0.727, specificity: 0.767) can accurately identify 23 out of 30 BBs, 48 out of 66 breast cancer patients; In addition, BC-BB (model: 0.796, sensitivity: 0.727, specificity: 0.767) can accurately identify 23 out of 30 BBs and 48 out of 66 breast cancer patients. I (AUC: 0.781, sensitivity: 0.700, specificity: 0.864) could accurately identify 21 out of 30 BC-I patients, 57 out of 66 samples from the other two groups, while Model BC-II (AUC: 0.759, sensitivity: 0.861, specificity: 0.550) could accurately identify 31 out of 36 BC-II patients and 33 out of 60 samples from the other two groups. The ROC-AUC values of the model were higher than 0.75, and the model still had high differential diagnostic ability, indicating that the abnormal sugar chain structure of protein in saliva of breast cancer patients may be potential in vitro detection markers for early screening of breast cancer patients.
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：2184732