【摘要】：乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤。雌激素通過與雌激素受體結合,激活特異的下游信號通路表達,刺激乳腺癌細胞的增殖,介導了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展�？勾萍に刂委熥鳛槿橄侔┲匾妮o助治療手段,可以明顯改善患者預后。然而并不是所有乳腺癌都能采用抗雌激素治療。對抗雌激素治療藥物的先天性耐藥和獲得性耐藥,都可引起抗雌激素抵抗,導致治療的失敗。因此,明確抗雌激素治療抵抗的分子機制,將極大的促進乳腺癌抗雌激素治療的發(fā)展,提高乳腺癌患者的治療效果,改善預后。目前已知雌激素受體ER-α表達下調或功能異常,是抗雌激素治療耐藥的主要原因。而ER-α轉錄表達的異常與表觀遺傳調節(jié)密切相關。但是ER-α表達下調的具體機制尚不完全清楚。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)轉錄因子ZEB1可以通過招募甲基轉移酶DNMT3B和去乙酰化酶HDAC1到ER-α基因啟動子,促進其發(fā)生高甲基化,從而誘導乳腺癌細胞中ER-α表達下調,導致抗雌激素治療耐藥。首先,我們通過在線數(shù)據(jù)庫預測分析發(fā)現(xiàn),在ER-α基因啟動子區(qū)存在一個大小為267 bp的Cp G島。利用DNMT3B和HDAC1抗體行染色質免疫共沉淀實驗Ch IP證明這個Cp G島是一個潛在的差異性甲基化調控區(qū)DMR。而在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn),ZEB1與乳腺癌組織中ER-α的表達呈負相關。并且我們同樣通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)這個Cp G島內包含有兩個ZEB1的潛在轉錄結合元件E2box序列。于是,我們檢測了乳腺癌細胞系MDA-MB-231/SUM-159和MCF-7/ZR75-1中ER-α基因啟動子甲基化程度,并且通過過表達及沉默ZEB1,從功能上證明了ZEB1對ER-α基因啟動子的甲基化調控作用。接下來,我們通過體外實驗中使用抗雌激素治療的代表性藥物他莫西芬(tamoxifen)和氟維司群(fulvestrant)處理乳腺癌細胞,證明了ZEB1過表達可以下調乳腺癌細胞ER-α的表達,并且降低乳腺癌細胞對抗雌激素藥物的敏感性;相反地,沉默ZEB1的表達可以部分恢復ER-α的表達,并且提高乳腺癌細胞對抗雌激素藥物的敏感性。機制研究證明,ZEB1可以同時與甲基轉移酶DNMT3B和去乙�；窰DAC1在ER-α啟動子上形成蛋白復合物,進而誘導DNA發(fā)生高甲基化,抑制ER-α的轉錄,沉默其表達。更重要的是,通過RNA干擾敲低ZEB1表達后可引起ER-α啟動子的去甲基化,進而部分恢復ER-α的表達,增加乳腺癌對抗雌激素治療的敏感性。最后,經過對乳腺癌臨床標本的分析,我們發(fā)現(xiàn)ZEB1和ER-α的蛋白表達評分呈負相關。在乳腺癌ER-α陰性病例中,ZEB1高表達,并且與ER-α啟動子高甲基化呈正相關,而在ER-α陽性性病例中,結果與之相反。在小鼠移植瘤模型中,我們進一步證明了下調ZEB1可以部分恢復ER-α的表達,并提高乳腺癌對抗雌激素治療的敏感性。綜上所述,我們的研究證明了ZEB1是介導乳腺癌抗雌激素耐藥的關鍵因子。ZEB1及其下游信號通路可能作為乳腺癌治療的新靶點。靶向ZEB1,并聯(lián)合應用特異的表觀調控抑制劑,有望成為克服乳腺癌抗雌激素治療耐藥的新策略。侵襲和轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因,而腫瘤血管生成是其侵襲和轉移的重要因素。在腫瘤血管生成過程中,血管內皮生長因子VEGF信號通路發(fā)揮了關鍵的調控作用。靶向血管內皮生長因子受體VEGFR2的小分子抑制劑,作為有效的抗血管新生藥物,已經廣泛應用于惡性腫瘤的臨床治療。其中代表性藥物為治療晚期腎癌的小分子藥物索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)。雖然臨床前研究和初期的臨床實驗得到了理想結果,但是隨著臨床的逐漸應用,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)這類藥物都存在一些未知的副作用,并且其療效也需要進一步驗證。因此,開發(fā)新型而低毒的VEGFR2小分子抑制劑仍然是當前研究的熱點。我們在本課題中,首先以sorafenib為藥物主體結構,采用計算機輔助設計,生物化學合成的方法,得到25個新型的靶向VEGFR2的小分子抑制劑。接著,以sorafenib為陽性對照,利用轉基因斑馬魚(Fli-1:EGFP)模型,對這些化合物的抗血管生成作用進行篩選,得到了一種高效且低毒的VEGFR2小分子抑制劑YLL545。接下來,我們同樣以sorafenib為陽性對照,用不同濃度的YLL545處理人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs。通過CCK8細胞活力實驗檢測發(fā)現(xiàn)YLL545抑制HUVECs細胞增殖的IC50為5.844μM。而進一步用Ed U細胞增殖實驗檢測發(fā)現(xiàn),YLL545抑制HUVECs的增殖是通過減少細胞S期DNA合成導致的。此外,劃痕實驗和transwell實驗提示YLL545可以抑制HUVECs細胞的遷移和侵襲。重要的是,成管實驗和Matrigel膠塞實驗證明,與sorafenib相比,YLL545能夠更有效地抑制HUVECs細胞的成管能力及其在小鼠體內的血管生成作用。進而,我們需要明確YLL545抑制血管生成的分子機制。通過WB檢測發(fā)現(xiàn),YLL545可以明顯抑制由VEGF誘導的VEGFR2磷酸化,及其下游信號調節(jié)因子的蛋白磷酸化水平,包括細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK、信號轉導子與轉錄激活子STAT3和雷帕霉素靶蛋白m TOR。此外,利用RT2 Profiler PCR Array,我們還發(fā)現(xiàn),YLL545可以通過VEGFR2非依賴途徑抑制其他血管生成相關基因的表達來影響血管生成,其中包括:FN1、TEK、ENG、THBS1和ITGAV。由于乳腺癌細胞同樣表達VEGFR2、m TOR、STAT3和ERK,提示YLL545具有潛在的靶向腫瘤細胞的作用。為此,我們選擇了乳腺癌細胞MDA-MB-231進行研究。通過CCK8、Ed U和平板克隆形成實驗均證明了2.5μM YLL545就能明顯抑制腫瘤細胞增殖,并且Annexin V和PI染色證明了YLL545還能促進MDA-MB-231細胞的凋亡。而YLL545抑制正常乳腺上皮細胞和肝上皮細胞增殖的IC50分別是35.83和33.40μM,表明YLL545對正常組織細胞的毒性甚小,其特異性抑瘤作用與細胞毒無關。最后,我們在小鼠移植瘤模型中驗證了YLL545抑制血管生成的體內作用。結果顯示,口服YLL545 50 mg/kg/d即可抑制乳腺癌移植瘤的血管生成,進而抑制腫瘤生長,抑制率達50%。并且與對照組相比,YLL545實驗組小鼠并未出現(xiàn)藥物毒副反應。綜上所述,作為一種新型、安全、高效的血管生成小分子抑制劑,YLL545有望將來應用于腫瘤,特別是乳腺癌的治療。
[Abstract]:Breast cancer is an estrogen-dependent tumor. Estrogen stimulates the proliferation of breast cancer cells by binding to estrogen receptors and activating specific downstream signaling pathways. Antiestrogen therapy, as an important adjuvant therapy for breast cancer, can significantly improve the prognosis of patients. All breast cancer can be treated with anti-estrogen therapy. Congenital and acquired resistance to anti-estrogen drugs can lead to anti-estrogen resistance and lead to treatment failure. Therefore, to clarify the molecular mechanism of anti-estrogen resistance will greatly promote the development of anti-estrogen therapy for breast cancer and improve the treatment of breast cancer patients. The abnormal expression of ER-alpha is closely related to epigenetic regulation. However, the specific mechanism of the down-regulation of ER-alpha expression is still unclear. In this study, we found that the transcription factor ZEB1 can pass through. Recruitment of promoters of methyltransferase DNMT3B and deacetylase HDAC1 to ER-alpha promoters promotes hypermethylation and induces down-regulation of ER-alpha expression in breast cancer cells, leading to resistance to estrogen therapy. First, we found a 267 BP CpG island in the promoter region of ER-alpha gene by online database prediction analysis. Chromatin immunoprecipitation assay with antibodies to DNMT3B and HDAC1 demonstrated that the Cp G island was a potential differentially methylated regulatory region DMR. In our previous study, ZEB1 was found to be negatively correlated with the expression of ER-alpha in breast cancer tissues. Thus, we examined the methylation of ER-alpha promoter in breast cancer cell lines MDA-MB-231/SUM-159 and MCF-7/ZR75-1, and functionally demonstrated the methylation regulation of ER-alpha promoter by ZEB1 overexpression and silencing. Treatment of breast cancer cells with tamoxifen and fulvestrant, a representative antiestrogen drug, demonstrated that ZEB1 overexpression could down-regulate the expression of ER-alpha in breast cancer cells and reduce the sensitivity of breast cancer cells to antiestrogen drugs; on the contrary, silencing ZEB1 expression could partially restore the expression of ER-alpha. Mechanisms have shown that ZEB1 can form protein complexes with methyltransferase DNMT3B and deacetylase HDAC1 on ER-a promoter simultaneously, which induces DNA hypermethylation, inhibits ER-a transcription and silences ER-a expression. More importantly, ZE is knocked down by RNA interference. After the expression of B1, the demethylation of ER-alpha promoter was induced, and the expression of ER-alpha was partly restored, which increased the sensitivity of breast cancer to anti-estrogen therapy. Promoter hypermethylation was positively correlated with ER-alpha in ER-alpha-positive cases, but the opposite was true in ER-alpha-positive cases. In a mouse transplanted tumor model, we further demonstrated that down-regulation of ZEB1 partially restored the expression of ER-alpha and increased the sensitivity of breast cancer to anti-estrogen therapy. ZeB1 and its downstream signaling pathways may be new targets for breast cancer treatment. Targeting ZEB1 and combining with specific inhibitors of epigenetic regulation may be a new strategy to overcome the resistance of breast cancer to estrogen therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway plays a key role in tumor angiogenesis. As an effective anti-angiogenesis drug, small molecule inhibitor targeting vascular endothelial growth factor receptor (VEGF R2) has been widely used in the clinical treatment of malignant tumors. Sorafenib and sunitinib are small molecule drugs for the treatment of advanced renal cell carcinoma. Although ideal results have been obtained in preclinical studies and initial clinical trials, with the gradual application of these drugs in clinic, some unknown side effects have been found in most of them, and their efficacy needs to be further verified. Therefore, the development of novel and low toxic small molecule inhibitors of VEGFR2 is still a hot research topic. In this project, we first used sorafenib as the main structure of the drug, using computer-aided design, biochemical synthesis methods, to obtain 25 novel small molecule inhibitors targeting VEGFR2. Then, sorafenib as a positive control, the use of. After screening the anti-angiogenesis effects of these compounds in transgenic zebrafish (Fli-1:EGFP) model, a high-efficiency and low-toxicity small molecule inhibitor of VEGFR2, YLL545, was obtained. Next, we treated HUVECs of human umbilical vein endothelial cells with different concentrations of YLL545 and sorafenib as positive control. The IC50 of YLL545 inhibited the proliferation of HUVECs was 5.844 mu M. Further studies using Ed U cell proliferation assay showed that YLL545 inhibited the proliferation of HUVECs by reducing S-phase DNA synthesis. In addition, scratch and Transwell experiments suggested that YLL545 could inhibit the migration and invasion of HUVECs cells. In addition, we need to clarify the molecular mechanism of YLL545 inhibiting angiogenesis. WB assay showed that YLL545 significantly inhibited the phosphorylation of VEGFR2 induced by VEGF, and YLL545 significantly inhibited the angiogenesis of HUVECs. Protein phosphorylation levels of downstream signal regulators, including extracellular regulated protein kinase ERK, signal transducer and activator of transcription STAT3 and rapamycin target protein M TOR, were measured. In addition, using RT2 Profiler PCR Array, we also found that YLL545 could inhibit the expression of other angiogenesis-related genes through the non-dependent pathway of VEGFR2. Because breast cancer cells also express VEGFR2, m TOR, STAT3 and ERK, YLL545 has the potential to target tumor cells. Therefore, we chose breast cancer cell MDA-MB-231 for our study. CCK8, Ed U and platelet cloning experiments have all proved that 2.5 mu YLL545 is effective. YLL545 could also promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells. The IC50 of YLL545 inhibited the proliferation of normal mammary epithelial cells and hepatic epithelial cells were 35.83 and 33.40 mu M, respectively, indicating that YLL545 had little toxicity to normal tissue cells, and its specific inhibitory effect on tumor was not related to cytotoxicity. Finally, we validated the inhibitory effect of YLL545 on angiogenesis in vivo in mice transplanted tumor model. The results showed that oral administration of YLL545 50 mg/kg/d could inhibit angiogenesis of breast cancer transplanted tumor, and then inhibit tumor growth, the inhibitory rate was 50%. Moreover, compared with the control group, YLL545 experimental group mice did not show any toxic and side effects. YLL545, as a novel, safe and effective angiogenesis inhibitor, is expected to be used in the treatment of cancer, especially breast cancer.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黃嘯原;用“印度閱兵”形容乳腺癌合適嗎?[J];診斷病理學雜志;2001年02期

2 張嘉慶,王殊,喬新民;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠景[J];中華外科雜志;2002年03期

3 張維彬,汪波,石靈春;中醫(yī)藥在現(xiàn)代乳腺癌治療中的運用[J];中國中西醫(yī)結合急救雜志;2002年01期

4 薛志勇;食物與乳腺癌[J];山東食品科技;2002年04期

5 王旬果,王建軍,鄭國華;乳腺癌相關標志物的研究進展[J];山東醫(yī)藥;2002年33期

6 陸尚聞;;男人也患乳腺癌[J];環(huán)境;2003年12期

7 ;新技術清晰拍攝早期乳腺癌細胞[J];上海生物醫(yī)學工程;2005年04期

8 田富國;郭向陽;張華一;;乳腺癌診治研究新進展[J];腫瘤研究與臨床;2005年S1期

9 馬濤,谷俊朝;血管內皮生長因子與乳腺癌的臨床研究進展[J];國外醫(yī)學(外科學分冊);2005年01期

10 郭慶良,谷俊朝;乳腺癌和瘦素相關性研究進展[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;2005年03期

相關會議論文 前10條

1 于永利;;抗乳腺癌免疫治療融合蛋白[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

2 郭紅飛;;中醫(yī)治療乳腺癌的策略[A];江西省中醫(yī)、中西醫(yī)結合腫瘤學術交流會論文集[C];2012年

3 龐朋沙;伍會健;;乳腺癌治療靶標的研究進展[A];北方遺傳資源的保護與利用研討會論文匯編[C];2010年

4 陸勁松;邵志敏;吳炅;韓企夏;沈鎮(zhèn)宙;;新型維甲酸抑制乳腺癌細胞的生長及誘導凋亡的機制研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

5 劉愛國;胡冰;;乳腺癌臨床治療進展[A];安徽省抗癌協(xié)會第四次代表大會暨乳腺癌、肺癌專業(yè)委員會成立會議、安徽省腫瘤防治進展學術研討會論文匯編[C];2001年

6 張嘉慶;王殊;喬新民;;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠景[A];第一屆全國中西醫(yī)結合乳腺疾病學術會議論文匯編[C];2002年

7 劉清俊;;乳腺癌綜合治療的新進展[A];山西省抗癌協(xié)會第六屆腫瘤學術交流會論文匯編[C];2003年

8 邵志敏;;21世紀乳腺癌治療的展望[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

9 陳松旺;張明;;乳腺癌治療的回顧與展望[A];西部地區(qū)腫瘤學學術會議論文匯編[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凱陽;王兆鉞;阮長耿;;組織因子途徑抑制物-2在乳腺癌細胞中的表達研究[A];第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2005年

相關重要報紙文章 前10條

1 ;血檢有望揭示乳腺癌治療效果[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

2 記者 鄭曉春;乳腺癌細胞擴散基因被找到[N];科技日報;2007年

3 中國軍事醫(yī)學科學院腫瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新療法[N];中國婦女報;2002年

4 王艷紅;抑制ＤＮＡ修補可消滅乳腺癌細胞[N];醫(yī)藥經濟報;2005年

5 詹建;乳腺癌飲食 兩個時期不一樣[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

6 辛君;乳腺癌擴散基因“浮出水面”[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

7 記者 毛黎;美發(fā)現(xiàn)有效抑制乳腺癌細胞生長的分子[N];科技日報;2010年

8 記者 吳春燕　通訊員 王麗霞;乳腺癌治療將有新途徑[N];光明日報;2011年

9 王樂　沈基飛;我科學家發(fā)現(xiàn)導致乳腺癌耐藥的新標志物[N];科技日報;2011年

10 劉霞;一種天然分子能阻止乳腺癌惡化[N];科技日報;2011年

相關博士學位論文 前10條

1 柴紅燕;疾病狀態(tài)下CYP4Z1和4A的生物學行為及其藥物干預研究[D];武漢大學;2012年

2 李凱;ID(inhibitor of DNA binding)家族蛋白調控乳腺細胞的分化并影響乳腺癌的預后[D];復旦大學;2014年

3 江一舟;乳腺癌新輔助化療前后基因變異檢測及其功能論證[D];復旦大學;2014年

4 馬邵;酪氨酸去磷酸化增強表皮生長因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究[D];山東大學;2015年

5 姚若斯;精氨酸甲基轉移酶PRMT7誘導乳腺癌細胞發(fā)生表皮—間質轉換及轉移的作用機制研究[D];東北師范大學;2015年

6 侯培鋒;α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)誘發(fā)高致瘤性干細胞樣乳腺癌細胞機制研究[D];福建醫(yī)科大學;2014年

7 李麗麗;分泌蛋白SHON調控乳腺癌細胞EMT的分子機制研究[D];東北師范大學;2015年

8 陳麗艷;PI3K抑制劑聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑對乳腺癌協(xié)同殺傷作用的分子機制研究[D];延邊大學;2015年

9 樸俊杰;乳腺癌差異基因篩選及PAIP1對其生物學行為的影響[D];延邊大學;2015年

10 汪[?如;染色體6q25.1區(qū)域基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感性的關聯(lián)研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 杜文英;乳腺癌分子亞型的臨床與病理特點[D];鄭州大學;2011年

2 賈曉菲;彩色多普勒超聲與乳腺癌病理及免疫組化指標的相關性研究[D];內蒙古大學;2015年

3 靳文;乳腺癌全基因組DNA甲基化修飾的研究[D];內蒙古大學;2015年

4 吳坤琳;TLR4/MyD88信號通路對乳腺癌侵襲性影響的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

5 葛廣哲;樹，

本文編號：2182979