【摘要】：背景：胃癌作為全世界最常見的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥死亡的第二大原因。雖然在手術(shù)及化療上取得了一定的進展,但是進展期胃癌的預(yù)后仍然較差,其五年生存率也只接近20%。在過去的十年里,靶向治療極大的改善了許多惡性腫瘤的預(yù)后,包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等,然而在胃癌方面的進展卻比較小。缺少與臨床密切相關(guān)的動物模型是阻礙靶向藥物發(fā)展的重要因素之一。小鼠體外細胞成瘤模型數(shù)十年來一直被用作臨床前抗腫瘤藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)工具,但是藥物進入臨床試驗后的高失敗率讓我們開始懷疑這個傳統(tǒng)的成瘤模型對藥物的預(yù)測能力。經(jīng)過長期的體外培養(yǎng)及篩選的細胞移植成瘤后,通常已經(jīng)丟失了來源腫瘤組織的分子特征和腫瘤異質(zhì)性,這也是其對臨床藥物反應(yīng)預(yù)測能力較差的原因。相比較體外細胞成瘤模型,病人組織來源腫瘤裸鼠移植瘤模型(patient derived tumor xenograft, PDTX)能很好的保持來源病人腫瘤組織在組織病理、遺傳及表型方面的特征,因而能較好的預(yù)測藥物的反應(yīng)性。近年來,大量PDTX模型在各種腫瘤中被建立起來,包括肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌及胃癌等。PDTX模型目前逐漸成為研究腫瘤生物學(xué)及評價抗腫瘤藥物的有效工具。 曲妥珠單抗被批準(zhǔn)用于治療生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)陽性的胃癌開啟了胃癌靶向治療的時代。其后至今卻只有雷莫蘆單抗(ramucirumab)和阿帕替尼(apatinib)兩個抗血管藥物被批準(zhǔn)用于晚期胃癌的二線治療,但是目前胃癌靶向治療對總生存率的提高仍然是有限的。因此研發(fā)新的藥物,尤其是靶向藥物,對胃癌治療尤為重要。近年來,較多的研究集中在了受體絡(luò)氨酸家族(RTK)成員上,這其中就包括了肝細胞生長因子受體(cMet)、成纖維細胞生長因子受體2(Gbroblast growth factor receptor2, FGFR2)、表皮生長因子受體(EGFR)等。目前許多研究正在探索相關(guān)通路抑制劑在胃癌中的抗腫瘤作用。胃癌PDTX模型可以作為篩選這些潛在靶向藥物的理想平臺,從而為進一步的臨床試驗提供可靠的數(shù)據(jù)支持。 第一部分： 背景：靶向治療正在成為胃癌新的治療選擇之一。PDTX模型能很好的保持來源腫瘤組織的特征,為臨床前藥物療效評估提供了一個有效的工具。本研究旨在建立胃癌PDTX模型,并探索針對IER2, cMet和FGFR2的靶向治療,為臨床進一步藥效試驗提供數(shù)據(jù)支持。 方法：從32例胃癌病人獲取胃癌組織移植入免疫缺陷小鼠中。利用免疫組織化學(xué)(IHC)和熒光原位雜交(FISH)評估一組胃癌病人HER2, cMet和FGFR2蛋白表達水平和基因擴增情況。最后,在PDTX模型中評價靶向藥物的抗腫瘤作用。 結(jié)果：9個能傳代的胃癌PDTX模型被成功的建立起來。在檢測的163例胃癌患者中分別有17(10.4%),32(19.6%)和6(3.7%)例出現(xiàn)HER2. cMet和FGFR2的分子改變,而在32例移植瘤供體中則分別為4(12.5%),8(25.0%)和1(3.1%)例。cMet的基因擴增或蛋白過表達(IHC3+)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。Critozinib和AZD4547分別只在cMet擴增(G30, G31)或FGFR2擴增(G03)的PDTX模型中呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤作用。有趣的是,在G03(FGFR2擴增,cMet無擴增但IHC2+)模型中,聯(lián)合Critozinib和AZD4547臺療能增加AZD4547的抗腫瘤作用。 結(jié)論：我們建立了一系列胃癌PDTX模型為藥物篩選和評價提供了一個理想的平臺。cMet和FGFR2基因擴增的胃癌患者有可能從靶向或聯(lián)合靶向cMet或FGFR2的治療中獲益。 第二部分 背景：cMet信號通路的異常激活參與腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移。cMet過表達的胃癌因為腫瘤的高轉(zhuǎn)移性及治療選擇上的局限性通常預(yù)后較差。木犀草素(Luteolin)是一種具有抗腫瘤作用的天然黃酮類化合物。但是目前Luteolin在cMet過表達胃癌中的作用還不清楚。 方法：建立2株cMet過表達的胃癌PDTX模型,利用Luteolin來處理PDTX模型并評價其抗腫瘤作用。將腫瘤標(biāo)本進行HE染色及免疫組化檢測。利用不同濃度的Luteolin來處理兩株高表達cMet的胃癌細胞系MKN45和SGC7901,通過Western blot、細胞活力檢測、細胞凋亡檢測、轉(zhuǎn)移及侵襲試驗等方法來評估Luteolin的抗腫瘤作用及對cMet信號通路的影響。 結(jié)果：Luteolin在cMet過表達的胃癌PDTX模型中能抑制明顯腫瘤的生長。免疫阻化提示cMet、MMP9和Ki-67蛋白的表達明顯下調(diào)。在MKN45和SGC7901細胞系中,Luteolin能抑制細胞的增殖,促進細胞凋亡及降低細胞的侵襲能力。Western blot結(jié)果提示Luteolin能促進凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和PARP-1的活化,并下調(diào)侵襲相關(guān)蛋白MMP9。進一步研究表明Luteolin能下調(diào)cMet蛋白的表達及磷酸化水平,及下游AKT和ERK的磷酸化水平。此外,Luteolin也能在不依賴cMet的情況下抑制AKT的磷酸化。利用PI3K抑制劑LY294002和／或ERK抑制劑PD98059能下調(diào)MMP9、cleaved caspase-3和cleaved PARP-1,與Luteolin的作用類似。 結(jié)論：本課題首次提出了Luteolin在cMet過表達的胃癌PDTX模型具有顯著的抗腫瘤作用,可能涉及到cMet/AKT/ERK信號通路。這些結(jié)果表明,Luteolin可以作為cMet過表達胃癌的潛在治療選擇。 第三部分 背景：甲胎蛋白分泌型胃癌(AFPGC)是一種具有高肝轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的罕見胃癌類型。相比與常見胃癌,AFPGC在靶向治療上的進展較小。本研究旨在探索幾個已知的靶點HER2、cMet、EGFR和VEGF在AFPGC患者中的表達情況,并進一步在胃癌PDTX模型中評估潛在的靶向治療方案。 方法：采用免疫組織化學(xué)(IHC)和熒光原位雜交(FISH)方法,我們在35例AFPGC病人及70例分期匹配的非AFPGC病人中評估HER2、cMet、EGFR和VEGF的蛋白表達及HER2和cMet的基因擴增情況。同時我們建立了甲胎蛋白分泌型胃癌PDTX模型來評估靶向治療的療效。 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)在／AFPGC組中cMet過表達的比例為48.5%,而在非AFPGC組則為20%。在AFPGC組VEGF過表達的比例為71.4%,而在非AFPGC組則為47.1%。同時,我們發(fā)現(xiàn)在AFPGC組中cMet和VEGF共同過度表達的比例為42.8%,并且這部分AFPGC患者預(yù)后更差。我們觀察到在cMet及VEGF共同過表達的胃癌PDTX模型中聯(lián)合靶向cMet (Crizotinib)和V EGF (Bevacizumab)信號通路治療能提高抗腫瘤作用。 結(jié)論：AFPGC中高頻率的出現(xiàn)cMet和VEGF共同過表達的情況,并且與不良預(yù)后相關(guān)。這一類特殊的AFPGC類型可能能夠從聯(lián)合靶向cMet和VEGF信號通路中受益。
[Abstract]:BACKGROUND: Gastric cancer is one of the most common malignant tumors in the world and the second leading cause of cancer death worldwide. Although some progress has been made in surgery and chemotherapy, the prognosis of advanced gastric cancer is still poor, and its five-year survival rate is only close to 20%. Targeted therapy has greatly improved many malignancies in the past decade. Prognosis of tumors, including breast, colorectal, and lung cancers, has made little progress in gastric cancer. Lack of clinical animal models is one of the important factors hindering the development of targeted drugs. The high failure rate of drugs in clinical trials has led us to question the predictive power of this traditional tumor-forming model for drugs. After long-term in vitro culture and screening of cells for tumor formation, the molecular characteristics and tumor heterogeneity of tumor origin have often been lost, which is also the ability to predict clinical drug response. Patient derived tumor xenograft (PDTX) can maintain the histopathological, genetic and phenotypic characteristics of the tumor tissues of the patients of origin, so it can better predict the drug responsiveness. In recent years, a large number of PDTX models have been used to predict the drug responsiveness. PDTX models have been established for cancer research, including lung, colorectal, breast, pancreatic and gastric cancer.
Trastuzumab has been approved for the treatment of human epidermal growth factor receptor-2 (HER2)-positive gastric cancer, opening the era of targeted therapy for gastric cancer. Nowadays, the total survival rate of gastric cancer is still limited by targeted therapy. Therefore, it is very important to develop new drugs, especially targeted drugs, for gastric cancer treatment. Receptor 2 (Gbroblast growth factor receptor 2, FGFR2), epidermal growth factor receptor (EGFR) and so on. At present, many studies are exploring the anti-tumor effects of inhibitors of related pathways in gastric cancer. Hold.
Part one:
BACKGROUND: Targeted therapy is becoming one of the new therapeutic options for gastric cancer. PDTX model can maintain the characteristics of tumor tissue and provide an effective tool for pre-clinical evaluation of drug efficacy. Provide data support.
METHODS: Gastric cancer tissues were obtained from 32 patients with gastric cancer and transplanted into immunodeficient mice. Immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) were used to evaluate the expression and gene amplification of HER2, cMet and FGFR2 in a group of patients with gastric cancer. Finally, the anti-tumor effect of targeted drugs was evaluated in PDTX model.
Results: Nine PDTX models of gastric cancer were successfully established. Among 163 gastric cancer patients examined, 17 (10.4%), 32 (19.6%) and 6 (3.7%) had molecular changes in HER2.cMet and FGFR2, respectively, while in 32 transplanted tumor donors, 4 (12.5%), 8 (25.0%) and 1 (3.1%) had gene amplification or protein overexpression (IHC3+) and Critozinib and AZD4547 showed significant antitumor effects in PDTX models with cMet amplification (G30, G31) or FGFR2 amplification (G03), respectively.
Conclusion: We have established a series of PDTX models for gastric cancer to provide an ideal platform for drug screening and evaluation. Patients with gastric cancer amplified by cMet and FGFR2 genes may benefit from targeted or combined targeted therapy with cMet or FGFR2.
The second part
BACKGROUND: Abnormal activation of cMet signaling pathway is involved in tumor growth, angiogenesis and metastasis. Overexpression of cMet in gastric cancer usually leads to poor prognosis because of its high metastasis and limited treatment options. Luteolin is a natural flavonoid compound with antitumor activity. However, Luteolin is overexpressed in cMet at present. The role of gastric cancer is unclear.
Methods: Two gastric cancer cell lines with overexpression of cMet, MKN45 and SGC7901, were treated with Luteolin, and their antitumor effects were evaluated. Apoptosis detection, metastasis and invasion assay were used to evaluate the antitumor effect of Luteolin and its effect on cMet signaling pathway.
Results: Luteolin could inhibit the growth of gastric cancer in PDTX model with overexpression of cMet. Immunosuppression indicated that the expressions of cMet, MMP9 and Ki-67 were down-regulated. Luteolin could inhibit the proliferation, promote apoptosis and decrease the invasiveness of cells in MKN45 and SGC7901 cell lines. Further studies have shown that Luteolin can down-regulate the expression and phosphorylation of cMet protein and the phosphorylation levels of downstream AKT and ERK. In addition, Luteolin can also inhibit the phosphorylation of AKT without cMet dependence. / or ERK inhibitor PD98059 could down-regulate MMP 9, cleaved caspase-3 and cleaved PARP-1, similar to Luteolin.
CONCLUSION: Luteolin PDTX model of gastric cancer overexpressing cMet has been proposed for the first time in this study. It may be involved in the cMet/AKT/ERK signaling pathway. These results suggest that Luteolin may be a potential therapeutic option for gastric cancer overexpressing cMet.
The third part
BACKGROUND: Alpha-fetoprotein-secreting gastric cancer (AFPGC) is a rare type of gastric cancer with high liver metastasis and poor prognosis. Compared with common gastric cancer, AFPGC has made less progress in targeted therapy. Evaluation of potential targeted therapies.
METHODS: Immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) were used to evaluate the expression of HER2, cMet, EGFR and VEGF in 35 AFPGC patients and 70 stage-matched non-AFPGC patients. Curative effect.
Results: We found that the overexpression of cMet was 48.5% in the / AFPGC group and 20% in the non-AFPGC group, 71.4% in the AFPGC group and 47.1% in the non-AFPGC group. The combination of targeted cMet (Crizotinib) and Bevacizumab (Bevacizumab) signaling pathways in a PDTX model of gastric cancer with co-expression of cMet and VEGF can enhance the anti-tumor effect.
CONCLUSION: High frequency of co-expression of cMet and VEGF in AFPGC may be associated with poor prognosis. This special type of AFPGC may benefit from co-targeting cMet and VEGF signaling pathways.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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