【摘要】：第一部分不同處理作用后樹突細胞對志愿者外周血免疫細胞體外擴增及功能影響的實驗研究目的:通過密度梯度離心法分離獲取志愿者外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)及臍帶血單個核細胞(Mononuclear Cells,MNCs),觀察經不同處理作用后樹突細胞(Dendritic cells,DCs)細胞表型表達差異,和其對志愿者外周血PBMCs體外擴增、分化的刺激促進能力,以及增殖后的免疫效應細胞對腫瘤靶細胞殺傷效率的差異;方法:1采用密度梯度離心法經志愿者外周血及臍帶血離心分離獲取PBMCs及MNCs,利用貼壁法純化獲取DCs并單獨培養(yǎng);2利用人結腸癌細胞株SW-1116作為靶細胞提取腫瘤特異性抗原(Tumor Special Antigen,TSA)并對外周血樹突細胞(Peripheral Dendritic cells,pDCs)及臍血來源樹突細胞(Umbilical Dendritic cells,uDCs)進行負載活化;3不同處理后的DCs與PBMCs進行體外混合培養(yǎng)擴增,利用流式細胞儀、酶聯免疫法及淋巴細胞毒性殺傷實驗觀察不同處理組DCs細胞表型和增殖擴增后的PBMCs細胞含量及種類的差異,以及培養(yǎng)上清中細胞因子γ干擾素(IFN-γ)的含量和對靶細胞殺傷能力的差異。結果:1不同處理組的DCs表型變化及抗原提呈能力差異:經TSA負載后的pDCs其CD83細胞表型較培養(yǎng)前(12.26±3.78)%明顯增高(55.69±5.24)%,表達差異有統(tǒng)計學意義(t=7.87,P=0.01);CD86的表達較培養(yǎng)前(35.71±4.44)%有明顯增高(87.99±4.94)%,表達差異有統(tǒng)計學意義(t=7.65,P=0.02)。經TSA負載后的uDCs其CD83細胞表型較培養(yǎng)前(13.79±2.18)%有所增高(31.65±8.01)%,但表達差異無統(tǒng)計學意義(t=2.15,P=0.10);CD86的表達較培養(yǎng)前(20.73±5.27)%有所增高(58.81±13.88)%,表達差異也無統(tǒng)計學意義(t=2.56,p=0.06)。2不同處理組dcs對pbmcs體外擴增的影響差異:負載tsa后的pdcs對pbmcs體外擴增有明顯促進作用,擴增后的pbmcs中含有cd3+cd8+t(40.22±1.13)%、cd3+cd4+t(36.68±0.55)%及cd3-cd56+nk(42.45±1.49)%等混合細胞;未負載tsa的pdcs對pbmcs體外擴增也有一定促進作用,擴增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(46.93±1.01)%、cd3-cd56+nk(37.39±2.04)%和cd3+cd8+t(24.88±0.55)%等混合細胞,其中cd3+cd8+t含量較負載tsa后的pdcs組明顯下降(f=242.01,p0.01);無pdcs的pbmcs體外培養(yǎng)后也有擴增,擴增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(53.18±2.16)%、cd3-cd56+nk(26.14±0.99)%及cd3+cd8+t(11.51±0.30)%等混合細胞,其中cd3+cd4+t含量較其他組明顯升高而cd3+cd8+t含量較其他組明顯降低(f=83.99,p0.01);負載tsa后的udcs對pbmcs體外擴增有較強地促進作用,擴增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(61.98±0.67)%、cd3+cd8+t(29.57±0.67)%和cd3+cd4+t(33.57±0.97)%等混合細胞,其中cd3-cd56+nk含量較其他組明顯增高(f=246.97,p0.01);未負載tsa的udcs對pbmcs體外擴增有一定促進作用,擴增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(62.08±1.79)%、cd3+cd8+t(20.12±0.55)%和cd3+cd4+t(54.71±0.68)%等混合細胞,其中cd3-cd56+nk含量與負載tsa后的udcs相似;3不同處理組dcs對pbmcs細胞培養(yǎng)上清ifn-γ含量的影響差異:負載tsa后的pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內ifn-γ含量為(11.64±0.91)pg/ml,隨著培養(yǎng)時間的延長增高至(63.03±1.69)pg/ml,培養(yǎng)前后差異有明顯統(tǒng)計學意義(t=19.76,p=0.03);未負載tsa的pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內ifn-γ含量較負載tsa的pdcs組低(10.92±0.89)pg/ml,隨著培養(yǎng)時間的延長其含量為(20.26±0.43)pg/ml,培養(yǎng)前后差異無統(tǒng)計學意義(t=7.08,p=0.09);無pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內ifn-γ含量為(10.04±0.69)pg/ml,且隨著培養(yǎng)時間的延長變化不明顯(15.11±1.79)pg/ml,培養(yǎng)前后差異無統(tǒng)計學意義(t=4.61,p=0.14);負載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內ifn-γ含量為(11.46±1.09)pg/ml,隨著培養(yǎng)時間的延長有增高趨勢(48.17±4.49)pg/ml,但培養(yǎng)前后差異無明顯統(tǒng)計學意義(t=6.58,p=0.09);未負載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組培養(yǎng)上清ifn-γ含量(11.63±0.55)pg/ml及變化趨勢(29.55±2.26)pg/ml與負載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組含量相似(t=10.46,p=0.06);4不同處理組dcs混合pbmcs培養(yǎng)后免疫效應細胞對結腸癌靶細胞sw-1116的殺傷效率差異:負載tsa的pdcs刺激擴增1周后的pbmcs對結腸癌靶細胞sw-1116的殺傷效率最高(63.93±0.75)%,具有很強的特異性殺傷能力(t=2.99,p=0.04);未負載tsa的pdcs刺激擴增1周后pbmcs對結腸癌sw-1116靶細胞有一定殺傷效率(30.91±0.03)%,但無明顯特異性殺傷能力(t=0.58,p=0.59);無pdcs存在的pbmcs擴增1周后對結腸癌sw-1116靶細胞也有殺傷效果(10.78±0.02)%,其殺傷效率低且無明顯特異性(t=0.69,p=0.53);負載tsa的udcs刺激擴增1周后pbmcs對結腸癌靶細胞sw-1116有一定殺傷效率(39.84±0.02)%,但其特異性殺傷能力不明顯(t=0.66,p=0.99);未負載tsa的udcs刺激擴增1周后pbmcs對結腸癌靶細胞sw-1116的殺傷效果(22.83±0.09)%與負載tsa的udcs組相同,也無明顯特異性殺傷能力(t=0.05,p=0.97)。第二部分轉染cd137l臍血樹突細胞對志愿者外周血免疫細胞體外擴增及功能影響的實驗研究目的:通過構建cd137l/pegfp-n1質粒,利用脂質體法將質粒轉染體外分離培養(yǎng)的udcs得到成功轉染后的工程udcs(transfectumbilicaldendriticcells,tudcs),觀察tudcs細胞表型變化及其對外周血pbmcs體外擴增及免疫功能的影響;方法:1通過基因庫查詢獲取cd137l基因的核心序列,針對cd137l基因cds區(qū)域設計并合成引物,其引物序列中添加利于質粒構建的限制性內切酶xho1及ecor1酶切位點序列;2利用pcr技術以目的基因引物為模板進行擴增,擴增產物經電泳鑒定后,利用膠切回收技術回收擴增后的目的基因擴增產物;3以pegfp-n1質粒作為表達載體,利用引物設計中的限制性內切酶酶切位點將擴增引物與表達載體質粒連接,并將帶有目的基因的質粒經dh5α感受態(tài)細胞轉化后擴增,同時經克隆pcr鑒定及陽性質粒抽提,獲取目的質粒,并送測序鑒定質粒中目的基因的表達;4經測序鑒定后的含有cd137l目的基因的pegfp-n1表達質粒(cd137l/pegfp-n1),利用無更換培養(yǎng)基的polodeliver3000轉染劑將cd137l/pegfp-n1加入udcs中混合培養(yǎng),通過熒光顯微鏡觀察轉染成功后tudcs表面熒光蛋白表達情況,通過流式細胞儀觀察tudcs表面cd137l表達情況;5將tudcs與pbmcs體外混合培養(yǎng),利用流式細胞儀、酶聯免疫法及淋巴細胞毒性殺傷實驗觀察tudcs細胞表型和增殖擴增后的pbmcs細胞含量及種類的差異,以及培養(yǎng)上清中細胞因子ifn-γ的含量和對靶細胞殺傷能力的差異。結果:1成功構建的cd137l/pegfp-n1質粒能夠順利轉染udcs并使其成功表達cd137l(31.65±0.23)%;2培養(yǎng)后tudcs其cd83細胞表型較培養(yǎng)前(10.23±0.68)%明顯增高(73.96±3.69)%,表達差異與未轉染組比較有明顯統(tǒng)計學意義(t=14.02,p0.01);細胞表型cd86較培養(yǎng)前(11.37±0.38)%有明顯增高(91.02±6.80)%,表達差異與未轉染組比較有明顯統(tǒng)計學意義(t=10.69,p0.01);3tudcs對pbmcs體外擴增有明顯促進作用;擴增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(92.79±1.59)%、cd3+cd4+t(47.25±1.05)%和cd3+cd8+t(21.64±1.99)%等細胞,cd3-cd56+nk細胞含量與未轉染組比較明顯增多(f=113.89,p0.01);4tudcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清ifn-γ含量檢測為(11.81±0.01)pg/ml,隨著培養(yǎng)時間的延長增高至(57.04±1.74)pg/ml,與未轉染組比較差異有明顯統(tǒng)計學意義(p=0.01);5tudcs刺激擴增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對結腸癌特異性靶細胞sw-1116有明顯的殺傷效率(51.52±0.05)%,其殺傷效率與負載tsa的udcs組(41.07±0.01)%相比無明顯統(tǒng)計學差異(p=0.09),而明顯高于空轉對照組(ctudcs)(31.29±0.04)%和未負載tsa的udcs組(31.01±0.01)%,組間差異比較有明顯統(tǒng)計學意義(p0.01);tudcs混合培養(yǎng)1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對結腸癌非特異性靶細胞ls-174-t同樣有明顯的殺傷效率(53.26±0.02)%,其殺傷效率明顯高于負載tsa的udcs組(38.32±0.02)%、ctudcs組(31.94±0.05)%和未負載tsa的udcs組(29.69±0.01)%,組間差異比較有明顯統(tǒng)計學意義(f=6.88,p=0.01);針對特異性靶細胞sw-1116和非特異性靶細胞ls-174-t,ctudcs組殺傷率無明顯差異(t=0.32,p=0.76)。第三部分轉染cd137l臍血樹突細胞對結直腸癌患者外周血自然殺傷細胞體外擴增及功能影響的實驗研究目的:采用密度梯度離心方法獲取結直腸癌患者外周血pbmcs及臍帶血mncs,采用貼壁法獲取udcs和腫瘤患者外周血dcs(tumorperipheraldendriticcell,tpdcs);通過轉染及抗原負載對udcs進行分組處理后使其分別與結直腸癌患者外周血pbmcs共培養(yǎng),觀察體外培養(yǎng)過程中不同處理組dcs對結直腸癌患者外周血pbmcs體外擴增、免疫功能恢復及免疫殺傷能力變化的影響差異。方法:1采用密度梯度離心的方法獲取結直腸癌患者外周血pbmcs及臍帶血mncs,通過貼壁法獲取腫瘤患者外周血tpdcs,分別進行體外培養(yǎng);2利用polodeliver3000轉染劑將構建成功的cd137l/pegfp-n1質粒、pegfp-n1質粒分別轉染至udcs細胞內即轉染組(tudcs)和空轉對照組(ctudcs)。將靶細胞sw-1116的ag負載tpdcs作為陽性對照組(tpdcs),將不同處理組dcs與患者外周血pbmcs混合培養(yǎng),利用流式細胞術、酶聯免疫吸附及淋巴細胞毒性殺傷實驗觀察其體外擴增能力、細胞分群、培養(yǎng)上清ifn-γ含量以及免疫效應細胞對腫瘤靶細胞殺傷效率的差異。結果:1tudcs對結直腸癌患者外周血pbmcs體外擴增有明顯促進作用,擴增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(91.63±0.49)%、cd3+cd4+t(9.15±4.65)%和cd3+cd8+t(19.15±0.60)%等細胞,其中cd3-cd56+nk含量明顯增高,與其他組間差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);2tudcs混合培養(yǎng)的pbmcs組上清ifn-γ含量為(57.05±0.87)pg/ml與培養(yǎng)前(9.69±0.34)pg/ml差異比較有統(tǒng)計學意義(t=50.78,p0.01),tudcs組上清ifn-γ含量與ctudcs組(18.35±2.63)pg/ml和tpdcs組(47.98±0.67)pg/ml比較,組間差異明顯(f=151.36,p0.01);3tudcs刺激擴增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對人結腸癌特異性靶細胞sw-1116(52.87±0.02)%和非特異性靶細胞ls-174-t(53.61±0.01)%都具有明顯的殺傷效率。ctudcs組對靶細胞sw-1116(29.16±0.07)%和ls-174-t(30.91±0.07)%的殺傷率低于tudcs組,差異比較有明顯統(tǒng)計學意義(p0.01);tudcs組對特異性靶細胞sw-1116殺傷率與tpdcs組比較,殺傷效率差異無明顯統(tǒng)計學意義(p=0.46);tudcs組對非特異性靶細胞ls-174-t殺傷率高于tpdcs組(37.91±0.01)%,組間差異比較有統(tǒng)計學意義(p=0.03);tudcs誘導擴增的腫瘤患者外周血cd3-cd56+nk對人結腸癌靶細胞sw-1116及l(fā)s-174-t細胞殺傷無靶細胞特異性(p=0.27)。第四部分轉染cd137l臍血樹突細胞激活的志愿者外周血自然殺傷細胞對荷瘤裸鼠的體內抗瘤作用影響的實驗研究目的:選擇scid/beige裸鼠作為研究對象,以人結腸癌sw-1116作為腫瘤細胞在裸鼠腋側皮下接種移植瘤后構建人結腸癌腫瘤模型;通過鼠尾靜脈回輸人外周血pbmcs細胞模擬重建人源化免疫環(huán)境狀態(tài);荷瘤后裸鼠明確腋下移植瘤移植成功,通過鼠尾靜脈回輸不同處理組活化擴增后的志愿者外周血免疫效應細胞,觀察荷瘤裸鼠的生活習性改變及生存時間,并記錄腫瘤體積、裸鼠體重、離體瘤重及裸鼠肝脾臟器重量等數據指標,從而評估免疫細胞在荷瘤裸鼠體內的抗腫瘤作用。方法:1培養(yǎng)擴增人結腸癌細胞株sw-1116細胞,收集生長對數期細胞作為移植瘤接種細胞;2選取5×105/0.5mlsw-1116細胞接種于裸鼠腋窩皮下處構建人結腸癌動物模型;選取1×106/0.5ml人pbmcs細胞經鼠尾靜脈回輸構建人源化免疫環(huán)境;觀察空白對照組(blank)、人源化對照組(cpbmcs)、抗原負載組(pdcs)和轉染組(tudcs)裸鼠,確定各組裸鼠移植瘤成瘤時間及瘤體體積大小的差異;3明確成瘤后實驗組及陽性對照組經鼠尾靜脈給予不同免疫效應細胞回輸,觀察不同處理組荷瘤小鼠生活習性改變及生存時間情況,記錄各組荷瘤裸鼠瘤體體積變化、裸鼠體重變化、裸鼠瘤體離體重量以及肝脾臟器重量,通過計算不同觀察指標從而評價免疫效應細胞在荷瘤裸鼠體內對移植瘤的抑制作用效果的差別。結果:1接種人結腸癌細胞株sw-1116細胞的各組裸鼠成瘤時間分別為blank組(4.71±0.18)ds、cpbmcs組(7.71±0.29)ds、pdcs組(7.86±0.26)ds和tudcs組(8.14±0.69)ds,blank組成瘤時間與其他三組比較,組間差異有統(tǒng)計學意義(f=40.96,p0.01);2cpbmcs組裸鼠成瘤體積(201.43±69.84)mm3低于blank組(436.04±54.50)mm3,差異比較有明顯統(tǒng)計學意義(t=4.02,p0.01);cpbmcs組裸鼠離體瘤重(1.25±0.12)g低于blank組(2.83±0.24)g,差異比較有明顯統(tǒng)計學意義(t=5.83,p0.01);離體腫瘤免疫組織化學染色觀察可見明顯cd3+cd4+t及cd3+cd8+t免疫細胞在腫瘤組織周圍浸潤;3 tuDCs組荷瘤裸鼠瘤體體積均值(92.11±11.55)mm3明顯低于Blank組(t=6.17,P0.01)和cPBMCs組(t=3.79,P0.01),差異比較有明顯統(tǒng)計學意義;tuDCs組荷瘤裸鼠離體瘤重均值(0.66±0.07)g明顯低于Blank組(t=8.57,P0.01)和cPBMCs組(t=4.21,P0.01),差異比較有明顯統(tǒng)計學意義;tuDCs組與pDCs組荷瘤裸鼠瘤體體積(85.61±11.59)mm3(t=0.39,P=0.69)及離體瘤重均值(0.63±0.09)g(t=0.33,P=0.75)比較,差異無明顯統(tǒng)計學意義。結論:1在IL2、IL-15共同存在的體外培養(yǎng)環(huán)境下,臍血樹突細胞能夠促進外周血PBMCs體外擴增,并可誘導細胞向CD3-CD56+NK細胞方向轉化且具備有較強的免疫殺傷功能;2利用PoloDeliver 3000轉染劑能夠將構建的CD137L/pEGFP-N1質粒成功轉染臍血樹突細胞并使其表面瞬時表達CD137L;3轉染CD137L/pEGFP-N1的臍血樹突細胞對外周血PBMCs體外培養(yǎng)擴增有明顯的促進作用,可誘導其轉化產生大量具有殺傷活性的CD3-CD56+NK細胞;4轉染CD137L/pEGFP-N1臍血樹突細胞可改善結直腸癌患者外周血PBMC免疫細胞的抑制狀態(tài),誘導并增強CD3-CD56+NK細胞數量及其免疫殺傷功能;5轉染CD137L/pEGFP-N1臍血樹突細胞誘導生成的CD3-CD56+NK細胞在體內體外均對腫瘤細胞有明顯的殺傷效應,可作為重要的臨床免疫治療細胞在腫瘤的預防、術后復發(fā)等方面為腫瘤臨床免疫治療方式提供新的策略。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：2179717