發(fā)布時(shí)間：2018-08-12 17:09

【摘要】：第一部分不同處理作用后樹突細(xì)胞對(duì)志愿者外周血免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增及功能影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:通過密度梯度離心法分離獲取志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)及臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclear Cells,MNCs),觀察經(jīng)不同處理作用后樹突細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)細(xì)胞表型表達(dá)差異,和其對(duì)志愿者外周血PBMCs體外擴(kuò)增、分化的刺激促進(jìn)能力,以及增殖后的免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤靶細(xì)胞殺傷效率的差異;方法:1采用密度梯度離心法經(jīng)志愿者外周血及臍帶血離心分離獲取PBMCs及MNCs,利用貼壁法純化獲取DCs并單獨(dú)培養(yǎng);2利用人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-1116作為靶細(xì)胞提取腫瘤特異性抗原(Tumor Special Antigen,TSA)并對(duì)外周血樹突細(xì)胞(Peripheral Dendritic cells,pDCs)及臍血來源樹突細(xì)胞(Umbilical Dendritic cells,uDCs)進(jìn)行負(fù)載活化;3不同處理后的DCs與PBMCs進(jìn)行體外混合培養(yǎng)擴(kuò)增,利用流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫法及淋巴細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)觀察不同處理組DCs細(xì)胞表型和增殖擴(kuò)增后的PBMCs細(xì)胞含量及種類的差異,以及培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子γ干擾素(IFN-γ)的含量和對(duì)靶細(xì)胞殺傷能力的差異。結(jié)果:1不同處理組的DCs表型變化及抗原提呈能力差異:經(jīng)TSA負(fù)載后的pDCs其CD83細(xì)胞表型較培養(yǎng)前(12.26±3.78)%明顯增高(55.69±5.24)%,表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.87,P=0.01);CD86的表達(dá)較培養(yǎng)前(35.71±4.44)%有明顯增高(87.99±4.94)%,表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.65,P=0.02)。經(jīng)TSA負(fù)載后的uDCs其CD83細(xì)胞表型較培養(yǎng)前(13.79±2.18)%有所增高(31.65±8.01)%,但表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.15,P=0.10);CD86的表達(dá)較培養(yǎng)前(20.73±5.27)%有所增高(58.81±13.88)%,表達(dá)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.56,p=0.06)。2不同處理組dcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增的影響差異:負(fù)載tsa后的pdcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增有明顯促進(jìn)作用,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3+cd8+t(40.22±1.13)%、cd3+cd4+t(36.68±0.55)%及cd3-cd56+nk(42.45±1.49)%等混合細(xì)胞;未負(fù)載tsa的pdcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增也有一定促進(jìn)作用,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(46.93±1.01)%、cd3-cd56+nk(37.39±2.04)%和cd3+cd8+t(24.88±0.55)%等混合細(xì)胞,其中cd3+cd8+t含量較負(fù)載tsa后的pdcs組明顯下降(f=242.01,p0.01);無pdcs的pbmcs體外培養(yǎng)后也有擴(kuò)增,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(53.18±2.16)%、cd3-cd56+nk(26.14±0.99)%及cd3+cd8+t(11.51±0.30)%等混合細(xì)胞,其中cd3+cd4+t含量較其他組明顯升高而cd3+cd8+t含量較其他組明顯降低(f=83.99,p0.01);負(fù)載tsa后的udcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增有較強(qiáng)地促進(jìn)作用,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(61.98±0.67)%、cd3+cd8+t(29.57±0.67)%和cd3+cd4+t(33.57±0.97)%等混合細(xì)胞,其中cd3-cd56+nk含量較其他組明顯增高(f=246.97,p0.01);未負(fù)載tsa的udcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增有一定促進(jìn)作用,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(62.08±1.79)%、cd3+cd8+t(20.12±0.55)%和cd3+cd4+t(54.71±0.68)%等混合細(xì)胞,其中cd3-cd56+nk含量與負(fù)載tsa后的udcs相似;3不同處理組dcs對(duì)pbmcs細(xì)胞培養(yǎng)上清ifn-γ含量的影響差異:負(fù)載tsa后的pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內(nèi)ifn-γ含量為(11.64±0.91)pg/ml,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長增高至(63.03±1.69)pg/ml,培養(yǎng)前后差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.76,p=0.03);未負(fù)載tsa的pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內(nèi)ifn-γ含量較負(fù)載tsa的pdcs組低(10.92±0.89)pg/ml,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其含量為(20.26±0.43)pg/ml,培養(yǎng)前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.08,p=0.09);無pdcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內(nèi)ifn-γ含量為(10.04±0.69)pg/ml,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長變化不明顯(15.11±1.79)pg/ml,培養(yǎng)前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.61,p=0.14);負(fù)載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清內(nèi)ifn-γ含量為(11.46±1.09)pg/ml,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長有增高趨勢(48.17±4.49)pg/ml,但培養(yǎng)前后差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.58,p=0.09);未負(fù)載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組培養(yǎng)上清ifn-γ含量(11.63±0.55)pg/ml及變化趨勢(29.55±2.26)pg/ml與負(fù)載tsa的udcs混合pbmcs培養(yǎng)組含量相似(t=10.46,p=0.06);4不同處理組dcs混合pbmcs培養(yǎng)后免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌靶細(xì)胞sw-1116的殺傷效率差異:負(fù)載tsa的pdcs刺激擴(kuò)增1周后的pbmcs對(duì)結(jié)腸癌靶細(xì)胞sw-1116的殺傷效率最高(63.93±0.75)%,具有很強(qiáng)的特異性殺傷能力(t=2.99,p=0.04);未負(fù)載tsa的pdcs刺激擴(kuò)增1周后pbmcs對(duì)結(jié)腸癌sw-1116靶細(xì)胞有一定殺傷效率(30.91±0.03)%,但無明顯特異性殺傷能力(t=0.58,p=0.59);無pdcs存在的pbmcs擴(kuò)增1周后對(duì)結(jié)腸癌sw-1116靶細(xì)胞也有殺傷效果(10.78±0.02)%,其殺傷效率低且無明顯特異性(t=0.69,p=0.53);負(fù)載tsa的udcs刺激擴(kuò)增1周后pbmcs對(duì)結(jié)腸癌靶細(xì)胞sw-1116有一定殺傷效率(39.84±0.02)%,但其特異性殺傷能力不明顯(t=0.66,p=0.99);未負(fù)載tsa的udcs刺激擴(kuò)增1周后pbmcs對(duì)結(jié)腸癌靶細(xì)胞sw-1116的殺傷效果(22.83±0.09)%與負(fù)載tsa的udcs組相同,也無明顯特異性殺傷能力(t=0.05,p=0.97)。第二部分轉(zhuǎn)染cd137l臍血樹突細(xì)胞對(duì)志愿者外周血免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增及功能影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:通過構(gòu)建cd137l/pegfp-n1質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的udcs得到成功轉(zhuǎn)染后的工程udcs(transfectumbilicaldendriticcells,tudcs),觀察tudcs細(xì)胞表型變化及其對(duì)外周血pbmcs體外擴(kuò)增及免疫功能的影響;方法:1通過基因庫查詢獲取cd137l基因的核心序列,針對(duì)cd137l基因cds區(qū)域設(shè)計(jì)并合成引物,其引物序列中添加利于質(zhì)粒構(gòu)建的限制性內(nèi)切酶xho1及ecor1酶切位點(diǎn)序列;2利用pcr技術(shù)以目的基因引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后,利用膠切回收技術(shù)回收擴(kuò)增后的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物;3以pegfp-n1質(zhì)粒作為表達(dá)載體,利用引物設(shè)計(jì)中的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增引物與表達(dá)載體質(zhì)粒連接,并將帶有目的基因的質(zhì)粒經(jīng)dh5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后擴(kuò)增,同時(shí)經(jīng)克隆pcr鑒定及陽性質(zhì)粒抽提,獲取目的質(zhì)粒,并送測序鑒定質(zhì)粒中目的基因的表達(dá);4經(jīng)測序鑒定后的含有cd137l目的基因的pegfp-n1表達(dá)質(zhì)粒(cd137l/pegfp-n1),利用無更換培養(yǎng)基的polodeliver3000轉(zhuǎn)染劑將cd137l/pegfp-n1加入udcs中混合培養(yǎng),通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染成功后tudcs表面熒光蛋白表達(dá)情況,通過流式細(xì)胞儀觀察tudcs表面cd137l表達(dá)情況;5將tudcs與pbmcs體外混合培養(yǎng),利用流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫法及淋巴細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)觀察tudcs細(xì)胞表型和增殖擴(kuò)增后的pbmcs細(xì)胞含量及種類的差異,以及培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子ifn-γ的含量和對(duì)靶細(xì)胞殺傷能力的差異。結(jié)果:1成功構(gòu)建的cd137l/pegfp-n1質(zhì)粒能夠順利轉(zhuǎn)染udcs并使其成功表達(dá)cd137l(31.65±0.23)%;2培養(yǎng)后tudcs其cd83細(xì)胞表型較培養(yǎng)前(10.23±0.68)%明顯增高(73.96±3.69)%,表達(dá)差異與未轉(zhuǎn)染組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.02,p0.01);細(xì)胞表型cd86較培養(yǎng)前(11.37±0.38)%有明顯增高(91.02±6.80)%,表達(dá)差異與未轉(zhuǎn)染組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.69,p0.01);3tudcs對(duì)pbmcs體外擴(kuò)增有明顯促進(jìn)作用;擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(92.79±1.59)%、cd3+cd4+t(47.25±1.05)%和cd3+cd8+t(21.64±1.99)%等細(xì)胞,cd3-cd56+nk細(xì)胞含量與未轉(zhuǎn)染組比較明顯增多(f=113.89,p0.01);4tudcs混合pbmcs培養(yǎng)組上清ifn-γ含量檢測為(11.81±0.01)pg/ml,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長增高至(57.04±1.74)pg/ml,與未轉(zhuǎn)染組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.01);5tudcs刺激擴(kuò)增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對(duì)結(jié)腸癌特異性靶細(xì)胞sw-1116有明顯的殺傷效率(51.52±0.05)%,其殺傷效率與負(fù)載tsa的udcs組(41.07±0.01)%相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.09),而明顯高于空轉(zhuǎn)對(duì)照組(ctudcs)(31.29±0.04)%和未負(fù)載tsa的udcs組(31.01±0.01)%,組間差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);tudcs混合培養(yǎng)1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對(duì)結(jié)腸癌非特異性靶細(xì)胞ls-174-t同樣有明顯的殺傷效率(53.26±0.02)%,其殺傷效率明顯高于負(fù)載tsa的udcs組(38.32±0.02)%、ctudcs組(31.94±0.05)%和未負(fù)載tsa的udcs組(29.69±0.01)%,組間差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(f=6.88,p=0.01);針對(duì)特異性靶細(xì)胞sw-1116和非特異性靶細(xì)胞ls-174-t,ctudcs組殺傷率無明顯差異(t=0.32,p=0.76)。第三部分轉(zhuǎn)染cd137l臍血樹突細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血自然殺傷細(xì)胞體外擴(kuò)增及功能影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:采用密度梯度離心方法獲取結(jié)直腸癌患者外周血pbmcs及臍帶血mncs,采用貼壁法獲取udcs和腫瘤患者外周血dcs(tumorperipheraldendriticcell,tpdcs);通過轉(zhuǎn)染及抗原負(fù)載對(duì)udcs進(jìn)行分組處理后使其分別與結(jié)直腸癌患者外周血pbmcs共培養(yǎng),觀察體外培養(yǎng)過程中不同處理組dcs對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血pbmcs體外擴(kuò)增、免疫功能恢復(fù)及免疫殺傷能力變化的影響差異。方法:1采用密度梯度離心的方法獲取結(jié)直腸癌患者外周血pbmcs及臍帶血mncs,通過貼壁法獲取腫瘤患者外周血tpdcs,分別進(jìn)行體外培養(yǎng);2利用polodeliver3000轉(zhuǎn)染劑將構(gòu)建成功的cd137l/pegfp-n1質(zhì)粒、pegfp-n1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至udcs細(xì)胞內(nèi)即轉(zhuǎn)染組(tudcs)和空轉(zhuǎn)對(duì)照組(ctudcs)。將靶細(xì)胞sw-1116的ag負(fù)載tpdcs作為陽性對(duì)照組(tpdcs),將不同處理組dcs與患者外周血pbmcs混合培養(yǎng),利用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附及淋巴細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)觀察其體外擴(kuò)增能力、細(xì)胞分群、培養(yǎng)上清ifn-γ含量以及免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤靶細(xì)胞殺傷效率的差異。結(jié)果:1tudcs對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血pbmcs體外擴(kuò)增有明顯促進(jìn)作用,擴(kuò)增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(91.63±0.49)%、cd3+cd4+t(9.15±4.65)%和cd3+cd8+t(19.15±0.60)%等細(xì)胞,其中cd3-cd56+nk含量明顯增高,與其他組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);2tudcs混合培養(yǎng)的pbmcs組上清ifn-γ含量為(57.05±0.87)pg/ml與培養(yǎng)前(9.69±0.34)pg/ml差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=50.78,p0.01),tudcs組上清ifn-γ含量與ctudcs組(18.35±2.63)pg/ml和tpdcs組(47.98±0.67)pg/ml比較,組間差異明顯(f=151.36,p0.01);3tudcs刺激擴(kuò)增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)對(duì)人結(jié)腸癌特異性靶細(xì)胞sw-1116(52.87±0.02)%和非特異性靶細(xì)胞ls-174-t(53.61±0.01)%都具有明顯的殺傷效率。ctudcs組對(duì)靶細(xì)胞sw-1116(29.16±0.07)%和ls-174-t(30.91±0.07)%的殺傷率低于tudcs組,差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);tudcs組對(duì)特異性靶細(xì)胞sw-1116殺傷率與tpdcs組比較,殺傷效率差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.46);tudcs組對(duì)非特異性靶細(xì)胞ls-174-t殺傷率高于tpdcs組(37.91±0.01)%,組間差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.03);tudcs誘導(dǎo)擴(kuò)增的腫瘤患者外周血cd3-cd56+nk對(duì)人結(jié)腸癌靶細(xì)胞sw-1116及l(fā)s-174-t細(xì)胞殺傷無靶細(xì)胞特異性(p=0.27)。第四部分轉(zhuǎn)染cd137l臍血樹突細(xì)胞激活的志愿者外周血自然殺傷細(xì)胞對(duì)荷瘤裸鼠的體內(nèi)抗瘤作用影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:選擇scid/beige裸鼠作為研究對(duì)象,以人結(jié)腸癌sw-1116作為腫瘤細(xì)胞在裸鼠腋側(cè)皮下接種移植瘤后構(gòu)建人結(jié)腸癌腫瘤模型;通過鼠尾靜脈回輸人外周血pbmcs細(xì)胞模擬重建人源化免疫環(huán)境狀態(tài);荷瘤后裸鼠明確腋下移植瘤移植成功,通過鼠尾靜脈回輸不同處理組活化擴(kuò)增后的志愿者外周血免疫效應(yīng)細(xì)胞,觀察荷瘤裸鼠的生活習(xí)性改變及生存時(shí)間,并記錄腫瘤體積、裸鼠體重、離體瘤重及裸鼠肝脾臟器重量等數(shù)據(jù)指標(biāo),從而評(píng)估免疫細(xì)胞在荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用。方法:1培養(yǎng)擴(kuò)增人結(jié)腸癌細(xì)胞株sw-1116細(xì)胞,收集生長對(duì)數(shù)期細(xì)胞作為移植瘤接種細(xì)胞;2選取5×105/0.5mlsw-1116細(xì)胞接種于裸鼠腋窩皮下處構(gòu)建人結(jié)腸癌動(dòng)物模型;選取1×106/0.5ml人pbmcs細(xì)胞經(jīng)鼠尾靜脈回輸構(gòu)建人源化免疫環(huán)境;觀察空白對(duì)照組(blank)、人源化對(duì)照組(cpbmcs)、抗原負(fù)載組(pdcs)和轉(zhuǎn)染組(tudcs)裸鼠,確定各組裸鼠移植瘤成瘤時(shí)間及瘤體體積大小的差異;3明確成瘤后實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組經(jīng)鼠尾靜脈給予不同免疫效應(yīng)細(xì)胞回輸,觀察不同處理組荷瘤小鼠生活習(xí)性改變及生存時(shí)間情況,記錄各組荷瘤裸鼠瘤體體積變化、裸鼠體重變化、裸鼠瘤體離體重量以及肝脾臟器重量,通過計(jì)算不同觀察指標(biāo)從而評(píng)價(jià)免疫效應(yīng)細(xì)胞在荷瘤裸鼠體內(nèi)對(duì)移植瘤的抑制作用效果的差別。結(jié)果:1接種人結(jié)腸癌細(xì)胞株sw-1116細(xì)胞的各組裸鼠成瘤時(shí)間分別為blank組(4.71±0.18)ds、cpbmcs組(7.71±0.29)ds、pdcs組(7.86±0.26)ds和tudcs組(8.14±0.69)ds,blank組成瘤時(shí)間與其他三組比較,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(f=40.96,p0.01);2cpbmcs組裸鼠成瘤體積(201.43±69.84)mm3低于blank組(436.04±54.50)mm3,差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.02,p0.01);cpbmcs組裸鼠離體瘤重(1.25±0.12)g低于blank組(2.83±0.24)g,差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.83,p0.01);離體腫瘤免疫組織化學(xué)染色觀察可見明顯cd3+cd4+t及cd3+cd8+t免疫細(xì)胞在腫瘤組織周圍浸潤;3 tuDCs組荷瘤裸鼠瘤體體積均值(92.11±11.55)mm3明顯低于Blank組(t=6.17,P0.01)和cPBMCs組(t=3.79,P0.01),差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;tuDCs組荷瘤裸鼠離體瘤重均值(0.66±0.07)g明顯低于Blank組(t=8.57,P0.01)和cPBMCs組(t=4.21,P0.01),差異比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;tuDCs組與pDCs組荷瘤裸鼠瘤體體積(85.61±11.59)mm3(t=0.39,P=0.69)及離體瘤重均值(0.63±0.09)g(t=0.33,P=0.75)比較,差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1在IL2、IL-15共同存在的體外培養(yǎng)環(huán)境下,臍血樹突細(xì)胞能夠促進(jìn)外周血PBMCs體外擴(kuò)增,并可誘導(dǎo)細(xì)胞向CD3-CD56+NK細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化且具備有較強(qiáng)的免疫殺傷功能;2利用PoloDeliver 3000轉(zhuǎn)染劑能夠?qū)?gòu)建的CD137L/pEGFP-N1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染臍血樹突細(xì)胞并使其表面瞬時(shí)表達(dá)CD137L;3轉(zhuǎn)染CD137L/pEGFP-N1的臍血樹突細(xì)胞對(duì)外周血PBMCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增有明顯的促進(jìn)作用,可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量具有殺傷活性的CD3-CD56+NK細(xì)胞;4轉(zhuǎn)染CD137L/pEGFP-N1臍血樹突細(xì)胞可改善結(jié)直腸癌患者外周血PBMC免疫細(xì)胞的抑制狀態(tài),誘導(dǎo)并增強(qiáng)CD3-CD56+NK細(xì)胞數(shù)量及其免疫殺傷功能;5轉(zhuǎn)染CD137L/pEGFP-N1臍血樹突細(xì)胞誘導(dǎo)生成的CD3-CD56+NK細(xì)胞在體內(nèi)體外均對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷效應(yīng),可作為重要的臨床免疫治療細(xì)胞在腫瘤的預(yù)防、術(shù)后復(fù)發(fā)等方面為腫瘤臨床免疫治療方式提供新的策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2179717