【摘要】：結(jié)直腸癌是世界上最常見的癌癥之一,也是死亡率最高的癌癥之一。當(dāng)患者確診為結(jié)直腸癌時(shí),約1/4的患者已經(jīng)發(fā)生了體內(nèi)癌組織的轉(zhuǎn)移,并且大部分的結(jié)直腸癌患者最終會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移癌。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的5年生存率較低,死亡率高。目前,對(duì)于結(jié)直腸癌的發(fā)生,尤其是轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的相關(guān)研究還不是很詳盡,結(jié)直腸癌的治療也未能取得良好的效果。因此,發(fā)現(xiàn)和鑒定與結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因,對(duì)于研究結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有非常重要的意義,不僅有助于我們了解和認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌,而且可以為結(jié)直腸癌的治療提供新的思路。Rhomboid domain containing protein 1(RHBDD1)是我們實(shí)驗(yàn)室前期在篩選睪丸cDNA文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高表達(dá)的新基因,最初我們將該基因命名為HSD50并提交至GenBank。因其含有rhomboid結(jié)構(gòu)域所以又稱為RHBDD1。RHBDD1是跨膜蛋白,在人中表達(dá)全長(zhǎng)315aa,含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),其中包含保守的Rhomboid domain,具有蛋白切割活性,是Rhomboid家族成員之一。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,RHBDD1可以切割tumour suppressor activated pathway-6 (TSAP6)、凋亡前提蛋白Bik和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor alpha, TGF-a)。我們實(shí)驗(yàn)室近期發(fā)現(xiàn)RHBDD1在結(jié)直腸癌中有較高的蛋白表達(dá)水平,其可以通過切割TGF-a從而激活表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)下游信號(hào)通路,從而對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)揮重要的作用。而RHBDD1和EGFR之間其他可能的關(guān)系還尚無相關(guān)研究,本文圍繞RHBDD1和EGFR的相互作用關(guān)系開展了深入的研究。我們首先研究了RHBDD1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。通過體外實(shí)驗(yàn),利用結(jié)直腸癌細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)RHBDD1敲除后細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力明顯降低。接著在裸鼠體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中觀察到,在RHBDD1敲除的實(shí)驗(yàn)組中,腫瘤的體積明顯減小,并且當(dāng)在RHBDD1敲除的細(xì)胞系中恢復(fù)RHBDD1后,小鼠皮下腫瘤明顯增大。接著觀察了RHBDD1對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。首先我們?cè)谂R床結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的患者中發(fā)現(xiàn),RHBDD1表達(dá)陽性和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。接著應(yīng)用細(xì)胞遷移和侵襲這兩個(gè)經(jīng)典的觀察癌轉(zhuǎn)移特性的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RHBDD1敲低后,結(jié)直腸癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力明顯降低。我們采用免疫缺陷鼠尾靜脈注射結(jié)直腸癌細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)觀察癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)現(xiàn),RHBDD1敲除或敲低時(shí),形成轉(zhuǎn)移灶的能力顯著降低并且轉(zhuǎn)移灶的體積顯著減小。以上實(shí)驗(yàn)說明RHBDD1可以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,其可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。為了研究RHBDD1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中具體分子機(jī)制,我們通過免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, CO-IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RHBDD1和EGFR的相互作用關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RHBDD1可以與EGFR發(fā)生相互作用。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RHBDD1可以和EGFR家族的四個(gè)成員(EGFR、HER2、HER3和HER4)都發(fā)生相互作用。又通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Immunofluorescence, IF)發(fā)現(xiàn),RHBDD1和EGFR在細(xì)胞中存在共定位情況。我們檢測(cè)了RHBDD1敲除后EGFR的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)EGFR的蛋白表達(dá)量明顯降低,并且HER2和HER4的表達(dá)量也明顯降低。在敲低RHBDD1后也可以觀察到EGFR蛋白表達(dá)減少。接著通過放線菌酮(cycloheximide,CHX)實(shí)驗(yàn)觀察RHBDD1對(duì)EGFR蛋白穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)RHBDD1敲除后,EGFR蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低,并且RHBDD1恢復(fù)表達(dá)后,EGFR蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性升高。我們對(duì)細(xì)胞給予EGF刺激,發(fā)現(xiàn)RHBDD1敲除的細(xì)胞EGFR降解加劇。同樣在RHBDD1敲低的細(xì)胞中也觀察到相同的現(xiàn)象。在觀察RHBDD1敲低后EGFR下游信號(hào)通路變化時(shí)發(fā)現(xiàn),p38蛋白質(zhì)磷酸化水平升高。我們進(jìn)一步觀察了RHBDD1對(duì)EGFR mRNA的影響。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低RHBDD1后EGFR mRNA的表達(dá)顯著降低,并且在RHBDD1敲除的細(xì)胞中重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí),觀察到一致的現(xiàn)象。接著我們發(fā)現(xiàn)RHBDD1敲低和敲除后EGFR蛋白質(zhì)和c-Jun蛋白質(zhì)表達(dá)都明顯減少。在RHBDD1敲除的細(xì)胞中外源表達(dá)c-Jun后發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)升高,并且呈現(xiàn)劑量依賴性,并且檢測(cè)到EGFR mRNA的表達(dá)顯著升高。我們也在小鼠皮下的腫瘤組織中檢測(cè)到RHBDD1敲低和敲除時(shí),EGFR和c-Jun的蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著降低。接著在結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本中,通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到RHBDD1、EGFR和c-Jun的表達(dá)水平趨勢(shì)一致。綜上所述,RHBDD1與EGFR存在相互作用的關(guān)系,發(fā)揮穩(wěn)定EGFR蛋白質(zhì)的作用。并且RHBDD1可以通過調(diào)節(jié)c-Jun來調(diào)節(jié)EGFR mRNA表達(dá),從而影響EGFR在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
[Abstract]:Colorectal cancer is one of the most common cancers in the world and one of the most fatal cancers. When patients are diagnosed with colorectal cancer, about 1/4 of the patients have undergone metastasis in the body, and most of the colorectal cancer patients eventually develop to metastatic cancer. The 5 year survival rate of metastatic colorectal cancer is low and the mortality rate is high. Previous studies on the occurrence of colorectal cancer, especially the molecular mechanisms of metastasis, are not very detailed, and the treatment of colorectal cancer has failed to achieve good results. Therefore, the discovery and identification of genes associated with the occurrence and metastasis of colorectal cancer is very important for the study of the molecular mechanisms of the occurrence and metastasis of colorectal cancer. It not only helps us understand and understand colorectal cancer, but also provides a new idea for the treatment of colorectal cancer.Rhomboid domain containing protein 1 (RHBDD1) is a highly expressed new gene found in our early laboratory screening of testicular cDNA library, and first we named the gene HSD50 and submitted to GenBank.. Because it contains the rhomboid domain so that RHBDD1.RHBDD1 is a transmembrane protein, it expresses a full length 315aa and contains 6 transmembrane structures, including the conservative Rhomboid domain, which is one of the members of the Rhomboid family. According to our previous research in the laboratory, RHBDD1 can cut tumour suppressor activate. D pathway-6 (TSAP6), apoptosis precondition protein Bik and transforming growth factor alpha (transforming growth factor alpha, TGF-a). Our laboratory recently found that RHBDD1 has a high protein expression level in colorectal cancer, and it can activate the downstream letter of the epidermal growth factor receptor by cutting TGF-a. The pathway of RHBDD1 plays an important role in the growth of the tumor. Other possible relationships between the RHBDD1 and the EGFR are still not related. This article focuses on the interaction of RHBDD1 and EGFR. We first studied the effect of RHBDD1 on the growth of the tumor. Now, the cell growth and proliferation ability of the cells decreased significantly after RHBDD1 knockout. Then, the tumor volume decreased significantly in the RHBDD1 knockout experimental group, and the subcutaneous swelling of the mice increased significantly after the RHBDD1 knockout cell line. Then, the tumor metastasis was observed by RHBDD1. First of all, we found a significant correlation between RHBDD1 expression positive and distal organ metastasis in patients with recurrent rectal cancer after surgery. Then, the two classics of cell migration and invasion were used to observe cancer metastasis. After RHBDD1 knockout, the migration and invasiveness of colorectal cancer cell lines were significantly reduced. When the tumor cell line was injected into the tail vein of the immunodeficient rat, the metastatic lesion was significantly reduced and the volume of the metastases decreased significantly when RHBDD1 was knocked down or knocked down. The above experiment indicated that RHBDD1 could affect the growth and metastasis of colorectal cancer cells, which may be in the occurrence of colorectal cancer and the occurrence of colorectal cancer. In order to study the specific molecular mechanism of RHBDD1 in the development of colorectal cancer, we verified the interaction between RHBDD1 and EGFR through the Co-immunoprecipitation (CO-IP) experiment, and found that RHBDD1 can interact with EGFR. Further experiments found that RHBDD1 can and Four members of the EGFR family (EGFR, HER2, HER3, and HER4) were interacted with each other. By immunofluorescence (Immunofluorescence, IF), it was found that RHBDD1 and EGFR were Co located in the cells. We detected the EGFR protein expression after the RHBDD1 knockout, and found that the expression of the EGFR protein was significantly reduced and the expression of the RHBDD1 was also expressed. EGFR protein expression decreased after knocking down RHBDD1. The effect of RHBDD1 on the stability of EGFR protein was observed by Actinomycate (cycloheximide, CHX), and the stability of EGFR protein was reduced after RHBDD1 knockout, and the stability of EGFR protein was increased after RHBDD1 resumed. Stimulated by EGF, the EGFR degradation of RHBDD1 knockout cells increased. The same phenomenon was also observed in RHBDD1 knockout cells. The phosphorylation level of p38 protein increased when the downstream EGFR signaling pathway of RHBDD1 knocked low. We further observed the effect of RHBDD1 on EGFR mRNA. We found that EGF after low RHBDD1 EGF. The expression of R mRNA was significantly reduced and the same phenomenon was observed during repeated experiments in the RHBDD1 knockout cells. Then we found that the expression of EGFR protein and c-Jun protein decreased significantly after the RHBDD1 knockout and knockout. The expression of EGFR in the RHBDD1 knockout cells showed a rise in the EGFR expression and a dose-dependent manner. The expression of EGFR mRNA was significantly increased. We also detected a significant decrease in the protein expression of EGFR and c-Jun in the tumor tissues of the subcutaneous tissue of the mice. Then in the tissue specimens of the colorectal cancer patients, the expression of RHBDD1, EGFR and c-Jun was consistent with the protein immunoblotting test. To sum up, RHBDD1 and EGFR interact with each other to play a role in stabilizing EGFR proteins. And RHBDD1 can regulate the expression of EGFR mRNA by regulating c-Jun, thereby affecting the role of EGFR in the development of colorectal cancer.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2161433