發(fā)布時間：2018-07-29 16:18

【摘要】：P90核糖體S6激酶(ribosomal S6Kinase, RSK)是信號通路Raf-MEK-ERK下游重要的作用靶點,屬于蘇氨酸絲氨酸激酶家族,迄今已發(fā)現此家族有4個成員RSK1-4,他們在調節(jié)細胞增殖、運動、生長、生存及侵襲等各種生命活動發(fā)揮著重要的作用。有關RSK1-3與腫瘤的關系的研究報道較多,在分子和細胞水平上的作用已比較清晰,而RSK4在結直腸癌研究較少,其功能和作用尚不明確。我們用免疫組織化學系統(tǒng)地分析了103例結直腸癌及相匹配的46例癌旁組織和正常組織中RSK4蛋白的表達水平。結果發(fā)現,RSK4蛋白在結直腸癌和癌旁組織和正常結直腸中表達相差較大,在結直腸癌組織中表達水平最低,RSK4蛋白的表達情況與結直腸癌腫瘤的惡性程度、淋巴結的轉移數目和臨床分期早晚緊密相關。單因素,多因素Cox風險模型發(fā)現RSK4低表達是結直腸癌眾多預后因素中一個相對獨立的預后較差的因子。在結直腸癌細胞SW480和HCT116中,我們用qRT-PCR和Western Blot檢測到RSK4呈低表達狀態(tài),利用Lipofectamin2000技術,我們觀察到轉染RSK4基因過表達后,用MTT法檢測到RSK4可以明顯抑制結直腸癌細胞的體外生長,隨著時間的延長,抑制效果越明顯,48至60小時達高峰,抑制率為60-70%。流式細胞儀檢測到轉染RSK4基因后,SW480和HCT116細胞的細胞周期發(fā)生了顯著的變化,G0/1期細胞比例上升較為明顯,DNA合成期(S期)細胞比例顯著下降。為了進一步觀察腫瘤的侵襲能力,Transwell實驗結果顯示,轉染RSK4基因的SW480和HCT116細胞侵襲能力明顯低于對照組。RSK4對腫瘤的侵襲轉移有重要的調節(jié)作用,而臨床和基礎實驗均證實腫瘤的侵襲轉移和腫瘤的間質上皮轉化密不可分。本文選擇了EMT相關分子Claudin-2, E-cadherin, P53, Snail,TGF-β,Twist及Vimentin,觀察轉染RSK4基因后各EMT相關分子的mRNA及蛋白的表達情況進行了分析,結果發(fā)現E-cadherin在轉染RSK4組呈高表達,Snail在SW480, HCT116兩株細胞呈低表達,而Claudin-2, P53, TGF-β,Twist, Vimentin的mRNA表達情況變化不大。其蛋白表達也有類似的情況,說明RSK4對腫瘤的侵襲轉移減弱可能是通過調節(jié)E-cadherin和Snail來實現的。本研究證實了RSK4可能為結直腸癌的抑癌基因,抑制結直腸癌的侵襲轉移,靶向RSK4有望成為結直腸癌的另一有效治療靶點。
[Abstract]:Ribosomal S6 kinase (RSK) is an important target in the downstream of Raf-MEK-ERK signaling pathway and belongs to the threonine serine kinase family. Up to now, four members of the family RSK1-4 have been found to regulate cell proliferation, movement and growth. Survival and invasion and other life activities play an important role. There are many reports about the relationship between RSK1-3 and tumor, the role of RSK4 in the molecular and cellular level has been more clear, but RSK4 in colorectal cancer research is less, its function and role is not clear. We systematically analyzed the expression of RSK4 protein in 103 cases of colorectal cancer and 46 matched adjacent tissues and normal tissues by immunohistochemistry. The results showed that the expression of RSK4 protein was significantly different in colorectal cancer and adjacent tissues and normal colorectal tissues. The expression level of RSK4 protein was the lowest in colorectal cancer tissues and the malignant degree of colorectal cancer. The number of lymph node metastases is closely related to the clinical stage. Univariate and multivariate Cox risk models showed that low expression of RSK4 was a relatively independent and poor prognostic factor among many prognostic factors in colorectal cancer. In SW480 and HCT116 cells of colorectal cancer, we detected the low expression of RSK4 by qRT-PCR and Western Blot. Using Lipofectamin2000 technique, we observed that after transfection of RSK4 gene, RSK4 could significantly inhibit the growth of colorectal cancer cells in vitro by MTT assay. With the prolongation of time, the inhibitory effect reached the peak at 48 ~ 60 hours, and the inhibition rate was 60-70. Flow cytometry showed that the cell cycle of SW480 and HCT116 cells changed significantly after transfection of RSK4 gene. The proportion of G0 / 1 phase cells increased significantly and the proportion of HCT116 cells decreased significantly in S phase. In order to further observe the invasiveness of tumor and the results of Transwell experiment, it was found that the invasion ability of SW480 and HCT116 cells transfected with RSK4 gene was significantly lower than that of control group. RSK4 had an important regulatory effect on tumor invasion and metastasis. Both clinical and basic experiments have confirmed that invasion and metastasis of tumor are closely related to the transformation of interstitial epithelium. The EMT related molecules Claudin-2, E-cadherin, p53, Snail-TGF- 尾 Twist and Vimentin were selected to analyze the expression of mRNA and proteins of EMT related molecules after transfection of RSK4 gene. The results showed that E-cadherin was highly expressed in RSK4 group and low in HCT116 cells. However, the expression of mRNA in Claudin-2, p53, TGF- 尾 Twistand Vimentin was not changed. The expression of RSK4 protein is similar, suggesting that the decrease of invasion and metastasis of RSK4 may be achieved by regulating E-cadherin and Snail. This study confirmed that RSK4 may be a tumor suppressor gene for colorectal cancer and inhibit invasion and metastasis of colorectal cancer. Targeted RSK4 may become another effective therapeutic target for colorectal cancer.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：2153231