【摘要】：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,主要發(fā)生于女性,偶見于男性。乳腺癌發(fā)病率在歐美等發(fā)達(dá)國家的女性惡性腫瘤中排第一位。乳腺癌在我國女性腫瘤發(fā)病率中亦高居榜首,并且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增。全國腫瘤登記中心公布的2016年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,我國的乳腺癌發(fā)病率近些年來明顯增高,每年新發(fā)病例為27.3萬,并且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化。乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性身心健康、危害女性生命的頭號殺手。近年來隨著乳腺癌早期診斷水平和健康普查的不斷提高,個體化治療設(shè)計已成為目前乳腺癌主要的治療策略,合理地綜合應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、生物靶向治療、內(nèi)分泌治療等多種治療手段,使得乳腺癌患者的總體生存率有了明顯提高。乳腺癌已經(jīng)成為預(yù)后較好的實體瘤之一。腫瘤是由多因素、多步驟、多基因、多信號途徑互相影響、互相作用的復(fù)雜生物學(xué)過程共同作用所形成的。乳腺癌的發(fā)病因素有多個,包括月經(jīng)初潮年齡和絕經(jīng)年齡、生育因素、哺乳情況、遺傳、生活方式、內(nèi)分泌狀況,情緒、電離輻射等均與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,多學(xué)科交叉后引發(fā)了從分子、基因等角度去探討腫瘤的發(fā)生發(fā)展的熱潮。microRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性的,短的非編碼RNAs,能夠通過與靶基因mRNA的3’-UTR的堿基互補配對來調(diào)節(jié)基因的表達(dá),并導(dǎo)致靶mRNA的降解,或者直接介導(dǎo)mRNA的降解。除此之外,miRNA也能夠在堿基與靶基因不完全配對時抑制翻譯。miRNA對細(xì)胞的增殖、形態(tài)、凋亡和分化等方面扮演重要角色并且具有組織特異性的特點,另外它在腫瘤的演進(jìn)過程中也起著重要作用。miRNA的異常表達(dá)通過調(diào)控靶基因的mRNA使其表達(dá)發(fā)生改變從而達(dá)到對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。miRNA調(diào)控基因表達(dá)成為腫瘤研究的新熱點�，F(xiàn)階段研究者從腫瘤的靶向治療和個體化治療出發(fā),進(jìn)行多種嘗試,并且已經(jīng)取得一定成果。因此,尋找新的分子靶點對于乳腺癌患者的診斷和治療以及改善預(yù)后都具有十分重要的意義。miRNA-205被發(fā)現(xiàn)了很長時間,但它的生物功能才剛剛開始被研究。研究顯示miRNA-205的表達(dá)在許多腫瘤中是減少的,miRNA-205起到腫瘤抑制作用并參與許多生理和病理過程。miRNA功能研究的核心是miRNA靶基因的研究,明確miRNA如何通過調(diào)控靶基因,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的哪些生命活動,以及怎樣影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。故而,miRNA研究工作中的重點和難點一直是發(fā)現(xiàn)并明確miRNA調(diào)控的靶基因及所參與的信號通路。血管的生成在腫瘤的生長過程必不可少,并且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移階段也發(fā)揮作用。Angiomotin(AMOT)是一種由675個殘基組成的蛋白質(zhì),又稱血管生成抑制素結(jié)合蛋白,顧名思義,是由一種膜相關(guān)蛋白與血管生成抑制素結(jié)合而形成。能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞隨機遷移以及內(nèi)皮細(xì)胞趨向生長因子的遷移。AMOT在侵襲性腫瘤中的表達(dá)比非侵襲性腫瘤中顯著增高,在乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)移者。然而AMOT的上調(diào)機制尚不明確。miRNA-205在乳腺癌中的表達(dá)是顯著下降的,有研究顯示在乳腺癌中AMOT的表達(dá)是顯著增高的,在表達(dá)量上兩者之間呈負(fù)相關(guān),所以我們選擇miRNA-205來分析AMOT在乳腺癌中的角色。我們推測miRNA-205對AMOT的表達(dá)有調(diào)控作用。但目前尚無關(guān)于miRNA-205對AMOT的調(diào)控作用的報道,以及在人乳腺癌細(xì)胞中miRNA-205對AMOT作用機制的研究。本研究分三部分內(nèi)容分別闡述miRNA-205與AMOT在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能作用以及其分子調(diào)控機制,為乳腺癌的診斷和治療帶來新的思路并且增強了我們對于AMOT轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的認(rèn)識。第一部分miRNA-205、AMOT在乳腺癌組織中的表達(dá)方法(1) 采用qRT-PCR技術(shù)檢測20例乳腺癌組織標(biāo)本和20例正常鄰近組織標(biāo)本中的miRNA-205的mRNA表達(dá)水平。(2) Real time PCR檢測AMOT在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的mRNA表達(dá)變化；Western Blot檢測AMOT在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)變化。(3) Real time PCR實驗檢測SKBR-3、MDA-MB-435S、MCF-7中miRNA-205的表達(dá)。(4)統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,所有實驗重復(fù)三次,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料采用x±s方式表達(dá)。組間比較采用單因素方差分析t-檢驗,P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(1) miRNA-205在乳腺癌組織中的表達(dá)量及癌旁正常組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,乳腺癌組織的表達(dá)(0.130±0.003)明顯低于癌旁正常組織(1.004±0.048),(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(2) Real time PCR法檢測AMOT在腫瘤組織中的表達(dá)(4.027±0.158)與匹配的正常組織(1.228±0.050)相比顯著上調(diào),(P0.0001)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot在蛋白水平的表達(dá)說明AMOT在乳腺癌組織中高表達(dá)。(3) Real time PCR檢測miRNA-205在不同的乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。以SKBR-3細(xì)胞株的miRNA-205的表達(dá)量為1,MDA-MB-435S的表達(dá)量為2.49±0.21,MCF-7的表達(dá)量為0.25±0.01,(P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MCF-7的表達(dá)量為最低,通過篩選,成為后續(xù)實驗細(xì)胞株。第二部分miRNA-205對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響方法(1)采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics至乳腺癌細(xì)胞72h后,用RT-PCR法測定miRNA-205的表達(dá)情況。(2)CCK8實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-70,12,24,48,96h生長曲線。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞凋亡情況。(4) Transwell檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞遷移實驗。(5)轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics以后分別以RT-PCR法和Western Blot檢測AMOT的表達(dá)水平,明確miRNA-205過表達(dá)對AMOT的表達(dá)的影響。(6)所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism6統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,每組實驗進(jìn)行3次,通過未配對獨立樣本t-檢驗或者單因素方差分析ANOVA,計數(shù)資料以x±s方式表達(dá)。P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(1)為了明確轉(zhuǎn)染miRNA-205mimics后miRNA-205的表達(dá)變化情況,我們在轉(zhuǎn)染后72h對miRNA-205進(jìn)行了RT-PCR檢測,以NC(陰性對照RNA)為對照組,以U6為內(nèi)參。結(jié)果顯示,miRNA-205的轉(zhuǎn)染可顯著上調(diào)miRNA-205的表達(dá)量(轉(zhuǎn)染后的相對表達(dá)量是NC組的82倍)。P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)我們通過CCK-8法對miRNA-205mimics處理前后的乳腺癌細(xì)胞生長情況進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示,隨著觀察時間的延長0,12,24,48,96h, mimics處理后的細(xì)胞生長明顯下降,存在時間依賴效應(yīng)。(3)用miRNA-205 mimic/NC處理后培養(yǎng)24小時,用Annexin V-FITC和PI染色后運用流式細(xì)胞檢測術(shù),進(jìn)一步明確miRNA-205對MCF-7細(xì)胞株的凋亡無影響,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。(4) Transwell實驗來檢測腫瘤細(xì)胞的運動能力。細(xì)胞分組：mimic組和NC,用Transwell小室實驗分別觀察細(xì)胞遷移能力,實驗結(jié)果顯示miRNA-205過表達(dá)能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力o mimic組為(175.1±9.16),NC組為(238.5±11.20),P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。(5)當(dāng)miRNA-205通過mimic過表達(dá)后,AMOT在mRNA水平的表達(dá)沒有受到明顯影響,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。但在蛋白水平的表達(dá)較NC變?yōu)楸磉_(dá)下降,P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。第三部分miRNA-205的靶基因及影響乳腺癌的分子機制探討方法(1)為了確定miRNA-205在乳腺癌中能夠調(diào)節(jié)AMOT表達(dá),我們應(yīng)用預(yù)測軟件TargetScan (www.targetscan.org)和miRDB (http://mirdb. org/miRDB)和MICRORNA (www.microrna.org)對miRNA-205靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了分析。(2)構(gòu)建質(zhì)粒并驗證,并將AMOT的3'UTR進(jìn)行基因突變,實驗分組NC+AMOT-3'UTR-WT; miR-205 mimics+AMOT-3'UTR-WT; NC+AMOT-3'UTR-MUT; miR-205 mimics+AMOT-3'UTR-MUT,以雙熒光素酶實驗驗證AMOT是否是miRNA-205的靶基因。(3)采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將siRNA或NC轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞,敲除AMOT后檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力以及對凋亡的影響。(4)采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染AMOT過表達(dá)質(zhì)粒然后以Western Blot法檢測AMOT的表達(dá),實驗分組為miRNA-205+AMOT-3'UTR-WT, miRNA-205+Vector(空質(zhì)粒)。(5)共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒與共轉(zhuǎn)染miRNA-205和空質(zhì)粒后進(jìn)行CCK-8實驗檢測MCF-7的增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力,進(jìn)一步檢測AMOT過表達(dá)后對MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并了解對miRNA-205過表達(dá)的影響。結(jié)果(1)運用生物信息學(xué)技術(shù)分析,根據(jù)互補配對原則,我們發(fā)現(xiàn),AMOT基因3’-UTR在2938-2945有一個序列片段可能與miRNA-205結(jié)合。(2)通過PCR產(chǎn)物電泳、雙酶切電泳及質(zhì)粒測序鑒定并Blast比對,證明質(zhì)粒構(gòu)建成功,雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證AMOT是miRNA-205的靶基因,各組熒光素酶相對活性值分別為：NC+AMOT-3'UTR-WT(4.79±0.24); miR-205mimics +AMOT-3'UTR-WT (2.34±0.23); NC+AMOT-3'UTR-MUT (4.8±0.16); miR-205 mimics +AMOT-3'UTR-MUT (4.52±0.25),結(jié)果說明miRNA-205與AMOT-3'UTR-WT的作用位點能夠結(jié)合(P0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義。(3) siRNA干擾AMOT后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)AMOT的蛋白表達(dá)顯著下降。通過CCK-8法對轉(zhuǎn)染siRNA處理前后的乳腺癌細(xì)胞生長情況進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示,隨著觀察時間的延長0,12,24,48,96h,siRNA處理后的細(xì)胞生長明顯下降,存在時間依賴效應(yīng)。流式細(xì)胞檢測術(shù)siRNA干擾AMOT后同miRNA-205過表達(dá)一樣對凋亡沒有影響。Transwell檢測乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果提示：MCF-7細(xì)胞的遷移能力顯著下降,NC組為(238.5±11.20)；AMOT-siRNA組為(124.4±10.4),P0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。。(4) AMOT過表達(dá)實驗進(jìn)一步證實AMOT是miRNA-205的靶基因,共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒或空質(zhì)粒后以Western Blot檢測AMOT在蛋白水平的表達(dá),提示較對照組(空質(zhì)粒)的AMOT表達(dá)水平顯著提高,提示AMOT過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miRNA-205 mimics對AMOT表達(dá)抑制。(5) 共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒后可以部分逆轉(zhuǎn)miRNA-205對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移的抑制作用。結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞株的生長抑制解除,且遠(yuǎn)超過對照組的細(xì)胞增殖,隨著時間的延長而顯著,在72h時這種解除效應(yīng)達(dá)到最大,在72-96h之間處于平臺期。細(xì)胞凋亡情況再次用流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果顯示無明顯差異,P0.05。Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力,空質(zhì)粒組為(136.1±13.8), AMOT過表達(dá)質(zhì)粒組為(219.1士11.48)。差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。共轉(zhuǎn)染AMOT過表達(dá)質(zhì)粒后,解除了miRNA-205過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞遷移的抑制。結(jié)論1、miRNA-205在乳腺癌中的表達(dá)下調(diào),AMOT在乳腺癌中的表達(dá)是顯著增高的,二者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2、miRNA-205過表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,但對凋亡無明顯影響；miRNA-205過表達(dá)對AMOT在mRNA水平的表達(dá)無明顯影響,但對蛋白水平的表達(dá)有抑制作用；3、AMOT是miRNA-205的直接靶基因,miRNA-205在乳腺癌細(xì)胞中通過作用于AMOT 3'-UTR特定位點來抑制其在蛋白水平的表達(dá)；AMOT過表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)miRNA-205過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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