發(fā)布時(shí)間：2018-07-23 14:51

【摘要】：第一部分乳腺癌組織中巨噬細(xì)胞及自噬標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)性及臨床意義目的:在乳腺癌組織芯片中檢測(cè)巨噬細(xì)胞(CD68)蛋白表達(dá)水平、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B蛋白表達(dá)水平,從而分析兩者之間的相關(guān)性;并結(jié)合乳腺癌標(biāo)本的臨床數(shù)據(jù)探討其臨床意義。方法:在含有160例乳腺癌組織的組織芯片中運(yùn)用免疫組織熒光雙染法,檢測(cè)巨噬細(xì)胞(CD68標(biāo)記)、以及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的表達(dá)情況。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析CD68與LC3B在臨床標(biāo)本中表達(dá)的相關(guān)性,Kaplan-Meier生存分析用于評(píng)價(jià)CD68和LC3B對(duì)總體生存率的影響;采用Cox回歸模型分析CD68、LC3B對(duì)預(yù)后影響的風(fēng)險(xiǎn)比和獨(dú)立性。結(jié)果:測(cè)得乳腺癌組織中CD68的平均光密度值為0.151297±0.0491mm-2,CD68高表達(dá)組(大于平均光密度值)在臨床分期Ⅲ期、Ⅱ-Ⅲ級(jí)、Ⅱ級(jí)的數(shù)量明顯高于CD68低表達(dá)組(p=0.016),但是兩組在腫瘤大小、患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及乳腺癌分子分型中分的布無(wú)顯著性差異(p0.05)。乳腺癌組織中LC3B單位面積平均光密度值為0.16300974±0.0438mm-2,LC3B高表達(dá)組(大于平均光密度值)在三陰性乳腺癌表達(dá)的數(shù)量明顯高于LC3B低表達(dá)組(p=0.016),兩組在乳腺癌臨床分期、患者年齡、TNM分期、腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的分布無(wú)顯著性差異(p0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示CD68與LC3B表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.327,p0.001)。高表達(dá)的CD68可顯著降低患者10年總體生存率(p=0.002),對(duì)5年總體生存率影響無(wú)顯著性差異(p=0.067),高表達(dá)的LC3B可顯著降低患者5年、10年總體生存率(p=0.042、p=0.001),Cox回歸分析結(jié)果得出LC3B的風(fēng)險(xiǎn)比為4.142,可以被看作為乳腺癌獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)之一(p=0.011)。結(jié)論:乳腺癌中巨噬細(xì)胞表達(dá)量與自噬相關(guān);巨噬細(xì)胞和自噬與乳腺癌病人的總體生存率密切相關(guān),LC3B可作為判斷乳腺癌病人不良預(yù)后的指標(biāo)之一。第二部分巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬及化療敏感性的影響目的:證實(shí)巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌自噬及觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響。方法:Western blot檢測(cè)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的乳腺癌細(xì)胞自噬情況,運(yùn)用自噬抑制劑CQ,使用si-RNA敲除乳腺癌細(xì)胞株中Beclin1、Atg7基因,檢測(cè)LC3B變化情況。乳腺癌細(xì)胞感染GFP-RFP-LC3腺病毒,共聚焦顯微鏡記錄巨噬細(xì)胞作用后乳腺癌細(xì)胞中形成自噬體。體外刺激人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞貼壁成為巨噬細(xì)胞,與乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468及MCF-7共培養(yǎng),同時(shí)加用紫杉醇(TAX),及自噬抑制劑CQ,流式測(cè)量各組凋亡情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分采用4T1細(xì)胞,4T1和RAW 264.7(M?)對(duì)BABL/c雌性小鼠進(jìn)行異種種植,小鼠成瘤后注射紫杉醇三周,觀測(cè)各組移植瘤瘤重的情況;免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠瘤石蠟切片中的LC3B表達(dá)情況。結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞刺激的的乳腺癌細(xì)胞中LC3B明顯升高。運(yùn)用藥物CQ抑制自噬潮,明顯增加乳腺癌細(xì)胞中LC3B含量。從基因?qū)用?敲除乳腺癌中Beclin1、Atg7后,巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬的激活作用明顯減弱。巨噬細(xì)胞作用乳腺癌16 h后,共聚焦顯微鏡記錄自噬體明顯增加。應(yīng)用紫杉醇后,與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的MDA-MB-468及MCF-7細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯減少,加入CQ抑制巨噬細(xì)胞引起的自噬可明顯增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAX的敏感性,凋亡明顯增加(p0.001)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,紫杉醇明顯縮小4T1組的腫瘤大小,對(duì)4T1+M?組作用不明顯。在小鼠瘤石蠟切片中4T1+M?組LC3B表達(dá)量較4T1組多,分布廣泛。結(jié)論:巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬,降低紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)可降低乳腺癌對(duì)紫杉醇的敏感性。第三部分巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬分子機(jī)制研究目的:探討巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。方法:細(xì)胞因子芯片篩選巨噬細(xì)胞所分泌的可能發(fā)揮作用的細(xì)胞因子,用ELLISA進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞因子的分泌情況。運(yùn)用si-RNA技術(shù)敲除巨噬細(xì)胞中篩選的細(xì)胞因子,與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測(cè)自噬變化情況;同時(shí)運(yùn)用外源性小分子合成物及細(xì)胞因子拮抗劑拮抗,檢測(cè)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬變化情況。檢測(cè)MAPK信號(hào)通路的激活情況,使用ERK通路抑制劑U0126抑制ERK、JNK通路抑制劑SP600125抑制JNK、p38信號(hào)通路抑制劑SB203580抑制p38表達(dá)后,觀察LC3B的表達(dá)情況,免疫組化檢測(cè)小鼠石蠟切片中被篩選出細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果:采用細(xì)胞因子芯片篩選,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞能夠分泌大量MIP-3α、MCP-3、ENA-78,其可能在巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬發(fā)揮作用。使用si-MIP-3α、si-ENA-78、si-MCP-3分別敲除巨噬細(xì)胞中這些細(xì)胞因子,敲除MIP-3α的巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬的激活作用明顯減弱。分別加入MIP-3α、MCP-3、ENA-78外源性小分子合成物,其中加入MIP-3α的乳腺癌細(xì)胞中LC3B表達(dá)量上調(diào),余無(wú)明顯變化;MIP-3α的拮抗劑作用巨噬細(xì)胞刺激的乳腺癌細(xì)胞,LC3B的表達(dá)量明顯減弱。Western blot結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞上調(diào)LC3B表達(dá)的同時(shí)伴隨MAPK信號(hào)通路的激活。運(yùn)用ERK抑制劑U0126后,LC3B表達(dá)明顯減弱,而運(yùn)用JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580,LC3B變化不明顯,敲除巨噬細(xì)胞中MIP-3α后,其對(duì)乳腺癌細(xì)胞ERK激活作用減弱,在小鼠瘤石蠟切片中4T1+M?組MIP-3α表達(dá)量較4T1組明顯增多。結(jié)論:巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌MIP-3α,進(jìn)而激活乳腺癌細(xì)胞中ERK通路,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬。
[Abstract]:The expression of CD68 and LC3B in breast cancer tissue was significantly higher than that in LC3B low expression group ( p = 0 . 016 ) . The correlation analysis showed that CD68 had positive correlation with LC3B expression ( r = 0 . 327 , p . 001 ) . The effect of macrophages and autophagy on the chemosensitivity of breast cancer cells was observed by Western blot . Western blot showed that macrophages were able to secrete large amounts of MIP - 3偽 , MCP - 3 , IL - 78 .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2139746