【摘要】：研究背景肝癌已成為全世界第五大最常見的惡性腫瘤和第三位腫瘤相關(guān)死亡的主要病因。大部分的肝癌患者診斷時(shí)屬于晚期階段,具有各種肝內(nèi)外的轉(zhuǎn)移。盡管多種先進(jìn)的治療手段用于肝癌的治療,如手術(shù)切除,射頻,微波消融,化療及肝臟移植,由于早期的轉(zhuǎn)移及頻繁的術(shù)后復(fù)發(fā),肝癌的預(yù)后非常差,5年的術(shù)后生存率僅為40%-50%。因此,肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)已成為影響預(yù)后的關(guān)鍵因素,尋找新的轉(zhuǎn)移機(jī)制并及時(shí)干預(yù)對(duì)提高患者的預(yù)后具有重要意義。越來(lái)越多的研究表明SIRT1在腫瘤進(jìn)展中的作用存在雙面性,SIRT1的高表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌,胰腺癌及黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,但上調(diào)SIRT1的表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲,然而SIRT1的表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后仍不清楚。該研究在明確SIRT1在肝癌中的表達(dá)模式及與臨床預(yù)后的相關(guān)性的基礎(chǔ)上,揭露SIRT1通過(guò)促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移而影響肝癌的預(yù)后,通過(guò)發(fā)現(xiàn)SIRT1與PGC-1α的相互作用,闡明了SIRT1通過(guò)促進(jìn)PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。研究方法(1)收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝膽外科不同分期的原發(fā)性肝癌患者術(shù)中的肝癌組織及相鄰非腫瘤組織共72例,同時(shí)收集5例無(wú)肝病的正常肝組織,術(shù)中收集的組織部分立即凍存于-80℃中,用于提取蛋白及RNA,另一部分組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋,切片成5μm用于免疫組織化學(xué)染色。Western blot用于檢測(cè)SIRT1在肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平,Real Time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT1在肝癌樣本中的m RNA表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)檢測(cè)SIRT1在肝癌組織中的表達(dá)部位及強(qiáng)度。(2)采用慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選的方式構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株。CCK-8試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞的活力,Cell-LightTM Ed U Apollo 567試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖,通過(guò)皮下移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT1對(duì)肝癌的成瘤性的影響。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)SIRT1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響,而檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲能力的改變通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)完成,尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除SIRT1后肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變,活體動(dòng)物成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)敲除SIRT1后肝癌細(xì)胞全身轉(zhuǎn)移形成的變化,而蘇木精伊紅染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞在肺組織中形成的腫瘤結(jié)節(jié)。(3)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT標(biāo)志物CK-18,vimentin,fibronectin在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。NAO染色和Mito Tracker?Red CM-H2XRos探針染色實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)肝癌細(xì)胞中敲除SIRT1對(duì)線粒體質(zhì)量的影響。采用E.Z.N.ATM DNA提取試劑盒提取細(xì)胞和裸鼠組織的總的DNA,然后通過(guò)Real Time PCR實(shí)驗(yàn)分析mt DNA copy number的變化,同時(shí)Real Time PCR實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)mt DNA編碼基因(COX I,ND1,ND6)的m RNA水平。采用ATP試劑盒分析肝癌細(xì)胞敲除SIRT1后及敲除SIRT1過(guò)表達(dá)PGC-1α后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIRT1對(duì)PGC-1α的去乙�；揎椂绊慞GC-1α的活性。通過(guò)構(gòu)建肝臟原位移植模型檢測(cè)肝癌細(xì)胞中敲除SIRT1和過(guò)表達(dá)PGC-1α對(duì)裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響�；铙w動(dòng)物成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌形成轉(zhuǎn)移灶的部位和時(shí)間。(4)統(tǒng)計(jì)分析方法:定量比較SIRT1的蛋白表達(dá)及m RNA水平在肝癌組織及相鄰非腫瘤組織中的差別采用配對(duì)t檢驗(yàn)。SIRT1的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的比較,根據(jù)分組的不同采用非參秩和檢驗(yàn),Spearman相關(guān)分析。而患者無(wú)病生存期和綜合生存率分別指從肝癌切除術(shù)當(dāng)天開始到患者第一次復(fù)發(fā)或者死亡的時(shí)間,采用Kaplan-Meier’s分析評(píng)估SIRT1的相對(duì)表達(dá)量與患者無(wú)病生存期和綜合生存率的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)中兩組間的數(shù)據(jù)采用Student’s t檢驗(yàn),而多組間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,而統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,雙側(cè)檢驗(yàn)P值小于0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果(1)SIRT1在肝癌細(xì)胞株中呈普遍的高表達(dá)相對(duì)于永生型肝細(xì)胞株L02,SIRT1在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平較相鄰的非腫瘤組織明顯增高(n=24,P=0.005),而SIRT1在肝癌組織中呈普遍高表達(dá)模式,過(guò)表達(dá)率為56.9%(41/72),而其蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中較相鄰非腫瘤組織明顯增高(n=72,P=0.012)。免疫組化顯示SIRT1在肝癌組織中的表達(dá)水平較相鄰非腫瘤組織及正常肝組織均明顯增高,且在肝癌組織中主要位于細(xì)胞核。臨床參數(shù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)增高的SIRT1表達(dá)水平與門靜脈癌栓形成(P=0.0039),肝癌晚期的TNM分期(P=0.0016)密切相關(guān),而與其他病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性,如年齡,性別,HBV感染,Child Pugh肝功能分級(jí),肝硬化程度,血清AFP水平,腫瘤大小,Edmondson Steiner病理分級(jí),Milan標(biāo)準(zhǔn)。Kaplan-Meier’s分析發(fā)現(xiàn)SIRT1過(guò)表達(dá)的患者較SIRT1低表達(dá)的患者有更短的無(wú)病生存期(P=0.021)和更差的綜合生存率(P=0.039),以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效指標(biāo)。(2)肝癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)或者敲除SIRT1不影響細(xì)胞的活力或者增殖,而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示在肝癌細(xì)胞MHCC97H中SIRT1敲除組與對(duì)照組顯示出相似的腫瘤細(xì)胞增殖曲線,且腫瘤體積和重量在兩組間無(wú)明顯差異。以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和成瘤性無(wú)明顯影響。肝癌細(xì)胞MHCC97中創(chuàng)傷愈合能力在SIRT1穩(wěn)定敲除組較陰性對(duì)照組明顯降低(P0.01),Transwell實(shí)驗(yàn)證明了敲除SIRT1顯著降低了MHCC97H細(xì)胞的遷移能力(P0.01)和損傷了MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力。另外,SIRT1過(guò)表達(dá)明顯增加了肝細(xì)胞株L02細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P0.05)。因此,以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞體外的遷移和侵襲能力。裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)中,熒光信號(hào)分析顯示SIRT1敲除的MHCC97H細(xì)胞形成的全身轉(zhuǎn)移較對(duì)照組明顯減少(P0.01),肝癌細(xì)胞MHCC97H在肝臟表面形成的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)在SIRT1敲除組較對(duì)照組明顯降低(P0.01),肝癌細(xì)胞MHCC97H的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率在SIRT1敲除組較對(duì)照組明顯降低。綜上所述,SIRT1的表達(dá)可促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。(3)肝癌細(xì)胞MHCC97H,SK-Hep1敲除SIRT1和Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SIRT1后,EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin,CK-18),間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin,α-SMA)和轉(zhuǎn)錄因子(snail,twist)的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。肝癌細(xì)胞MHCC97H敲除SIRT1對(duì)一系列EMT關(guān)鍵標(biāo)志物(E-cadherin,fibronectin,vimentin,twist,and snail)的m RNA水平無(wú)明顯影響。免疫熒光染色顯示在肝癌細(xì)胞MHCC97H和SK-Hep1中沉默SIRT1的表達(dá)不能誘導(dǎo)EMT的進(jìn)程。缺氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞Hep G2過(guò)表達(dá)SIRT1也不能影響EMT標(biāo)志物的表達(dá)。TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌EMT模型中,SIRT1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明SIRT1的表達(dá)對(duì)肝癌EMT的進(jìn)程無(wú)明顯的影響。肝癌細(xì)胞MHCC97H在穩(wěn)定敲除SIRT1后,線粒體的質(zhì)量、線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COX I,ND1,ND6)、細(xì)胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam,COX IV,TOMM20)的蛋白水平均明顯降低,以上結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中敲除SIRT1降低了線粒體發(fā)生的能力及損傷了線粒體的功能,導(dǎo)致了生物能量產(chǎn)生的缺陷。臨床標(biāo)本研究中SIRT1的過(guò)表達(dá)與PGC-1α的上調(diào)在肝癌組織相對(duì)于相鄰的非腫瘤組織存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.569,P0.001);在肝癌細(xì)胞MHCC97H和Huh7中過(guò)表達(dá)SIRT1可明顯增加PGC-1α的表達(dá)水平,而MHCC97H細(xì)胞中敲除SIRT1可明顯升高PGC-1α的乙酰化水平從而降低了PGC-1α的活性。而在肝癌細(xì)胞Huh7,MHCC97H中過(guò)表達(dá)PGC-1α明顯增加了細(xì)胞的遷移、侵襲能力,提高了細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA編碼基因(COX I,ND1,ND6)的m RNA水平,該結(jié)果表明PGC-1α促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲通過(guò)增強(qiáng)線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)的。過(guò)表達(dá)PGC-1α明顯恢復(fù)了肝癌細(xì)胞MHCC97H因敲除SIRT1所致的降低的遷移和侵襲能力,同時(shí),線粒體DNA拷貝數(shù),線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COX I,ND1,ND6),細(xì)胞內(nèi)ATP水平和線粒體發(fā)生相關(guān)基因(Tfam,COX IV,TOMM20)的蛋白水平在過(guò)表達(dá)PGC-1α而敲除SIRT1的MHCC97H組中較單獨(dú)敲除SIRT1的MHCC97H細(xì)胞組明顯增高,該結(jié)果表明過(guò)表達(dá)PGC-1α可逆轉(zhuǎn)SIRT1敲除對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和線粒體發(fā)生降低的抑制效應(yīng)。在裸鼠原位抑制模型中,肝癌細(xì)胞SIRT1敲除組的熒光信號(hào)強(qiáng)度和肺組織腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量較對(duì)照組明顯降低,而過(guò)表達(dá)PGC-1α后可逆轉(zhuǎn)該抑制效應(yīng),而來(lái)源于裸鼠轉(zhuǎn)移性肺組織的線粒體DNA拷貝數(shù),線粒體DNA轉(zhuǎn)錄本(COX I,ND1,ND6)及線粒體發(fā)生相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平在敲除SIRT1的MHCC97H組中較對(duì)照組明顯降低,而過(guò)表達(dá)PGC-1α后可恢復(fù)其表達(dá)水平,該結(jié)果表明PGC-1α介導(dǎo)的線粒體發(fā)生增強(qiáng)在SIRT1促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究結(jié)論綜上所述,SIRT1普遍高表達(dá)于肝癌組織,且其相對(duì)表達(dá)水平與肝癌微血管侵犯,腫瘤TNM分期,肝癌的復(fù)發(fā)和綜合生存率具有明顯的相關(guān)性,表明SIRT1的表達(dá)水平可作為評(píng)估肝癌轉(zhuǎn)移的有效的預(yù)后指標(biāo)。敲除SIRT1明顯降低肝癌細(xì)胞的體外侵襲和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1可明顯降低線粒體發(fā)生的水平和減少ATP的產(chǎn)生,但卻不影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的進(jìn)程。肝癌組織中SIRT1的過(guò)表達(dá)與PGC-1α的上調(diào)明顯相關(guān),而肝癌細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)SIRT1明顯增加PGC-1α的表達(dá)水平,敲除SIRT1的表達(dá)可降低PGC-1α的活性。通過(guò)細(xì)胞株及肝臟原位移植模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGC-1α的過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)敲除SIRT1所致的肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的降低,是通過(guò)增強(qiáng)線粒體的發(fā)生而介導(dǎo)。通過(guò)該研究,闡明了SIRT1促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制,為探索高效的用于SIRT1/PGC-1α軸的靶向治療提供理論依據(jù),為豐富肝癌的個(gè)體化治療和提高預(yù)后具有積極的意義。
[Abstract]:In this study , the expression of SIRT1 in hepatocellular carcinoma ( HCC ) and the metastasis of hepatocellular carcinoma ( HCC ) were studied . The effects of SIRT1.On the expression of SIRT1.In HCC cell lines , the effects of SIRT1.On the expression of SIRT1.On the basis of the analysis of the expression of SIRT1.In this paper , we studied the effect of SIRT1.On the expression of SIRT1.In this paper , we studied the effect of SIRT1 on the lung metastasis of hepatocellular carcinoma . 鍏嶇柅緇勫寲鏄劇ずSIRT1鍦ㄨ倽鐧岀粍緇囦腑鐨勮〃杈炬按騫寵緝鐩擱偦闈炶偪鐦ょ粍緇囧強(qiáng)姝ｅ父鑲濈粍緇囧潎鏄庢樉澧為珮,涓斿湪鑲濈檶緇勭粐涓富瑕佷綅浜庣粏鑳?yōu)鏍?涓村簥鍙傛暟鐩稿叧鍒嗘瀽鍙戠幇澧為珮鐨凷IRT1琛ㄨ揪姘村鉤涓庨棬闈?rùn)鑴夌檶鏍撳舰鎴?P=0.0039),鑲濈檶鏅氭湡鐨凾NM鍒嗘湡(P=0.0016)瀵嗗垏鐩稿叧,鑰屼笌鍏朵粬鐥呯悊鍙傛暟鏃犳槑鏄劇浉鍏蟲，

本文編號(hào)：2136610